缺氧诱导因子1α在乳腺癌中的表达及对化疗药物增敏机制影响的初步研究

摘要

目的：本实验拟阐明缺氧诱导因子1α在乳腺浸润性导管癌中的表达及与葡萄糖转运蛋白1和乳腺癌独立临床预后因素的关系，证实缺氧诱导因子1α在缺氧环境下乳腺癌细胞中存在对下游葡萄糖转运蛋白1和P糖蛋白的调控，并进一步影响乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性以及抑制缺氧诱导因子1α表达后，对于乳腺癌细胞在裸鼠体内生长的影响。 方法：对我院乳腺病理科保存的部分乳腺良恶性肿瘤的标本中的HIF-1α和GLUTI蛋白进行免疫组化研究，检测两种蛋白在乳腺肿瘤中的表达，并探求其与乳腺癌临病理床特征的关系及病人复发转移的关系。采用氯化钴作为细胞乏氧诱导剂，检测本实验室保存的T47D和MCF-7细胞中不同氧条件下HIF-1α的表达，筛选缺氧条件下高表达细胞株。构建靶向HIF-1α的小干扰RNA真核表达载体，转染至人乳腺癌T47D细胞内，建立稳定抑制HIF-1α的细胞株，并采用RT-PCR和Western-blot方法进行鉴定。我们进一步采用稳定表达小干扰RNA的乳腺癌T47D细胞株，分别加入不同浓度的紫杉醇和表阿霉素，采用MTT法检测细胞在化疗药物中的增殖活性，评价沉默HIF-1α表达后对于化疗药物的增敏效果，并采用实时定量PCR和Western-blot方法检测P-gp和GLUT1的表达，采用流式细胞仪检测肿瘤细胞周期的变化，探讨其可能机制。裸鼠皮下接种不同组处理细胞，观察肿瘤生长情况，计算抑瘤率，并对肿瘤组织中的HIF-1α和GLUT1的表达进行免疫组化检测，明确HIF-1α受抑制后肿瘤的生长情况，印证体外试验结果。 结果：HIF-1α和GLUT1在乳腺浸润性导管癌标本中表达率分别为56.7％和63.3％，二者表达存在相关性和一致性，而在乳腺纤维瘤组织中未检测到二者的表达(P<0.05)。HIF-1α和GLUT1表达与乳腺癌患者的性别、年龄，肿瘤大小及雌孕激素受体无关，而与淋巴结转移数目相关。乳腺癌MCF-7和T47D细胞中均存在HIF-1α表达，免疫印迹实验证实经氯化钴缺氧诱导，可以促进细胞中HIF-1α的稳定表达。采用RT-PCR，实时定量PCR和Western-blot方法证实我们获得有效抑制HIF-1α表达的阳性细胞克隆。RNAi沉默T47D细胞中的HIF-1α表达后，分别在mRNA水平和蛋白水平检测到GLUT1和P-gp的表达下调。PI单染法证实缺氧可以诱导G0/G1肿瘤细胞增多，而抑制HIF-1α表达后，细胞周期发生改变，MTT法证实在缺氧条件下T47D细胞对紫杉醇和表阿霉素的化疗敏感性增强。裸鼠皮下移植瘤实验表明，抑制HIF-1α的表达，能够明显抑制皮下移植肿瘤的生长，免疫组化实验证实GLUT1表达亦随之下降。 结论：糖酵解是肿瘤细胞获得能量的一个重要手段，缺氧条件下尤其如此，HIF-1α通过与靶基因上的DNA结合位点结合，诱导糖酵解酶类基因的表达，促进糖酵解和葡萄糖转运过程的进行，而同样抑制了HIF-1α的表达，通过抑制糖酵解及葡萄糖转运途径也可以上调肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性，有效地杀灭在缺氧微环境中对化疗药物耐药的肿瘤细胞。因此，HIF-1α是乳腺肿瘤治疗潜在的分子靶点，采用RNAi的方法针对它的基因靶向治疗和传统的化疗相结合可能会得到更好的效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、缺氧诱导因子-1α和葡萄糖转运蛋白1在乳腺肿瘤中的表达

1.1对象和方法

1.2结果

1.3讨论

1.4小结

二、RNAi沉默T47D细胞中HIF-1α表达对化疗药物的增敏效果及机制初探

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4小结

三、RNAi沉默HIF-1α表达对乳腺癌细胞生长影响的体内实验

3.1对象和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 缺氧诱导因子1α在恶性肿瘤治疗中的研究进展

致谢