酸枣仁皂苷A引起的肠道和主要脏腑之间的信息交流

摘要

酸枣仁作为国家颁布的第一批药食同源食品之一,具有养心补肝,宁心安神,敛汗,生津的功效,主要用于治疗虚烦不眠,惊悸多梦、体虚多汗,津伤口渴等症。酸枣仁皂苷A是酸枣仁镇静催眠的主要活性成分,其作用机理尚待进一步研究。肠道是人体的一个重要器官,研究表明其含有多种受体并可分泌多种细胞因子,在调节机体的免疫及信息传递中发挥重要的生理作用。本文研究了酸枣仁皂苷A在体内各个组织中的分布情况,考察了酸枣仁皂苷A对于大鼠海马细胞GABA受体表达的影响,并利用细胞因子来探讨肠道与各个脏腑之间的信号交流关系,为更好、更全面、更准确的研究酸枣仁皂苷A镇静催眠作用机理提供依据,主要研究结果如下:
　　应用液质联用技术(HPLC-MS/MS)测定大鼠血浆及心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、肠组织中酸枣仁皂苷A的含量,确定药物在大鼠体内主要组织中的分布情况。结果表明,2 mg/kg的剂量对大鼠静脉注射后,酸枣仁皂苷A在体内迅速分布,各个组织中的酸枣仁皂苷A在20-2000ng/mL浓度范围内线性关系均良好,r>0.9990,提取回收率>80％。精密度均小于15%,可于体内组织分布的测定。经过检测酸枣仁皂苷A在肠组织中的药物浓度最高(2930.20±518.96 ng/mL),脑组织中最少(144.27±22.31ng/mL),依次分布情况:肾脏>脾脏>肝脏>肺>胃>心脏>肌肉。组织中的药物浓度均随时间的延长而降低,在体内未见有明显的特殊积蓄现象,药物在检测时间内于4h时降至较低水平。
　　以神经元微管蛋白-2(MAP-2)作为神经细胞标志物,运用免疫荧光技术对体外元代培养的海马细胞进行纯度鉴别。以海马细胞作为模型,通过用高、中、低三种不同浓度的酸枣仁皂苷A作用海马细胞,以细胞存活率为考察指标,考察酸枣仁皂苷A对海马细胞的生长作用。结果表明,海马细胞呈绿色荧光且特征明显,纯度较好。不同浓度酸枣仁皂苷A(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)作用海马细胞24h后,与空白对照组相比,低、中、高三个剂量的酸枣仁皂苷A的细胞存活率均大于100%,25μg/mL组P>0.05,50μg/mL和100μg/mL组P<0.05,有显著差异,证明在在该浓度下的酸枣仁皂苷A具有促进海马细胞生长的作用。
　　利用荧光定量PCR技术,考察枣仁皂苷 A对于SD大鼠海马细胞 GABA受体mRNA表达的影响。与空白对照组比较酸枣仁皂苷A作用细胞48h后,25μg/mL组GABAAα1、GABAAα5、GABABR1受体 mRNA(relative toβ-Actin)表达量显著升高(P<0.05),GABAAβ1表达量降低(P<0.05)。50μg/mL和100μg/mL组 GABAAα1、GABABR1、GABAAα5和GABAAβ1受体mRNA表达量均显著升高(P<0.05),不同浓度同一受体的基因表达量但之间存在一定的剂量相关性。与药物作用48h相比,50μg/mL的酸枣仁皂苷 A作用海马细胞24h后,GABAAα1受体 mRNA表达量升高(P<0.01),GABABR1、GABAAα5表达量降低(P<0.05),均具有显著性。GABAAα1和GABAAβ1受体mRNA的表达量趋势相同。然而,GABABR1、GABAAα5受体mRNA的表达量是随药物作用时间的延长而升高,显示出一定的时效关系。酸枣仁皂苷A和地西泮分别作用海马细胞24h,其受体基因表达水平高于地西泮,酸枣仁皂苷A可能在发挥镇镇静催眠作用时较地西泮更加迅速有效。
　　用液体芯片技术对细胞因子进行检测,考察肠道与脏腑之间的信息交流关系。实验中通过对细胞因子的检测,寻找细胞因子的表达分泌细胞和靶细胞,根据其相互作用关系做出细胞和细胞之间的作用关系表,以此表绘制出细胞通讯网络图,从而直观地显示出肠道与脏腑之间的关系。实验结果表明,肠道在受到酸枣仁皂苷A刺激后,会在空白培养上清液中分泌细胞因子,继而这些释放在培养液中的细胞因子(经循环系统)传递到其他脏腑组织调节相应细胞因子的表达和分泌,并通过计算得到肠道对各个脏腑组织作用的强弱关系为:心>脾>脑>肝>肺>胃>肾。细胞因子是肠道和脏腑发生联系的重要信号分子,通过分析细胞因子来建立细胞通讯网络,为探讨肠道与脏腑之间进行通讯联系提供了一种新方法和有力手段。

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第一章 前 言

1.1研究现状

1.2 GABA受体与睡眠

1.3 肠道及其与脏腑间的信号传递

1.4 本文的立题背景、意义、依据

第二章 酸枣仁皂苷A在SD大鼠各组织中的分布

2.1仪器与材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三章 酸枣仁皂苷A对大鼠海马细胞GABA受体mRNA表达的影响

3.1 大鼠神经细胞培养

3.2 免疫荧光法鉴别大鼠海马细胞纯度

3.3酸枣仁皂苷A对大鼠海马细胞活力的影响

3.4 海马细胞总RNA的提取

3.5 酸枣仁皂苷A对大鼠海马细胞GABA受体mRNA表达的影响

第四章 酸枣仁皂苷A引起的大鼠肠道和主要脏腑之间的信息交流

4.1 仪器与材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第五章 结 论

1.1 酸枣仁皂苷A在SD大鼠各组织中的分布

1.2 大鼠海马细胞的培养

1.3 酸枣仁皂苷A对大鼠海马细胞GABA受体mRNA表达的影响

1.4 酸枣仁皂苷A引起的肠道与主要脏腑之间的信息交流

1.5 进一步工作构想

参考文献

论文及参加科研情况说明

致谢