三七素手性药物代谢动力学研究噻唑硫磷质量控制及残留监测

摘要

三七素，又名田七氨酸，Neurotokin，化学名为β-草酰基-L-α，β-二氨基丙酸，是豆科、五加科植物中含有的一种非蛋白氨基酸。药理实验表明，三七素注射后显示出良好的止血活性。在多种出血模型中均具有明显的预防性和治疗性止血作用。对血小板病、血小板无力症和血小板减少出血性紫斑病有明显的改善。由于在低剂量时即显示出良好的止血效果，有效止血剂量与中毒剂量相差较远，因此作为一类高效止血新药进行研究与开发有较好的前景。 本文以化学合成的三七素为目标化合物，采用元素分析，红外、紫外、质谱、核磁共振四大光谱法，结合热重分析、单晶X射线衍射等分析手段，并将合成品与三七生药中分离得到的天然三七素进行了比旋度的比较，对全合成的三七素的化学结构进行了研究和确证。在此基础上，对三七素的外观性状、理化性质、含量及有关物质限量进行了系统的质量控制方法的研究。含量测定方法，针对三七素具有氨基酸的两性结构、极性强、无特征紫外吸收的特点，分别探讨了酸碱滴定、甲醛滴定、非水滴定、凯氏定氮等容量分析方法和离子对高效液相色谱法。其中采用非水滴定的逆滴定法、凯氏定氮法和离子对高效液相色谱法均可成功的测定三七素含量，结果准确，精密度良好。但前两种方法由于无分离效能，仅可作为杂质极少的对照品的含量测定方法。在原料的质量标准中，选用离子对高效液相色谱法。有关物质的检查方法，在考察了纸层析、薄层层析和高效液相色谱法后，由于高效液相色谱法具有更高的检测灵敏度和分离效能，将该法列入标准作为检查杂质限度的方法。 三七素结构中含有一个手性碳原子，根据空间构型的不同，分为D-，L-两个手性异构体。大量的研究表明，D-，L-三七素有着相同或近乎相当的药理活性，却有着截然不同的毒理特征。天然植物中含有L-型三七素，在大量使用后，会产生尿频、下肢无力、足跟不易抬起等神经毒症状，而D型三七素在高剂量使用后，无上述中毒症状出现。为了进一步研究D-，L-三七素产生的毒副作用是否与其血药浓度有相关性，以及考察二者在体内手性代谢动力学上是否具有立体选择性差异，我们进行了该化合物的手性代谢研究。 为了获得足够量的外消旋三七素以供手性分离及代谢研究，本文仿照L-三七素的合成路线，以外消旋的天冬酰胺为原料，通过天冬酰胺中胺基的磺酰化保护、脱去羰基、去除磺酰化保护基得到a，β-二氨基丙酸以及a，β-二氨基丙酸中β位氨基的草酰化四步反应，制得了外消旋的三七素。反应的总收率与L-三七素相当。 三七素的手性分离方法目前尚无文献报道。文中综合了可用于α—氨基酸手性分离的多种方法对三七素进行手性拆分的尝试。经典的手性气相色谱法，将三七素结构中极性基团羧基进行酯化、氨基进行酰化处理后，在手性氨基酸衍生物固定相“Chirasil-Val”上可获得对映体的良好分离。但由于三七素本身化学结构的不稳定性，在酯化过程中，伴随着目标产物三七素二酯的出现，还有两个副产物产生，反应条件的优化和产物的纯化，均无法获得单一产物。由于衍生化反应不能定量的进行，给对映体的准确定量带来了困难。高效液相色谱法的分离尝试，分为直接法和间接法两种方式。直接HPLC法是运用手性固定相直接分离对映体或对映体的衍生物。根据三七素的化学结构，选定冠醚作为手性固定相，对映体仅得到部分分离。优化色谱条件也未能获得基线分离。直接法的另一种方式，是在三七素结构中通过衍生化反应分别引入萘环和芴环，在手性环糊精柱上进行拆分。引入萘环后，萘环的大小与β-环糊精空腔尺寸合适，进入空腔内，紧密结合，使得三七素手性碳上的取代基与空腔边缘的醇羟基充分接触，提供足够的手性识别作用力，满足了“三点相互作用”的手性识别模式，从而在环糊精手性柱上分离了三七对映异构体。间接HPLC法，即手性试剂衍生化HPLC，利用三七素与邻苯二甲醛(OPA)和具有光学纯度的手型试剂N-异丁酰-L-半胱氨酸发生衍生化反应，生成一对理化性质具有明显差异的非对映异构体。在常规的反相柱上实现了对映体的间接分离。为了找到合适的手性试剂促成衍生化后对映体的良好分离，文中合成了一系列不同酰化取代的L一半胱氨酸。试验表明，随着取代基碳链的延长和空间位阻的增大，对映体的分离度增加。 在获得了多种可以拆分三七素对映体的色谱方法后，文中进行了三七素对映体的体内代谢动力学研究。选用间接HPLC法作为分离血样中三七素对映体的方法。血样的前处理采用固相萃取。取血浆样品，加入内标羧甲司坦溶液，方法：采用经右侧颈总动脉结扎加缺氧处理的2日龄SD大鼠PVL模型，应用荧光定量PCR方法检测缺氧缺血后12h、24h、48h、72 h GluR2 mRNA表达的变化；Western Blot检测GluR2蛋白含量交化。统计方法采用秩和检验和成组t检验。 结果：(1)与对照组相比，PVL组新生大鼠脑白质GIuR2mRNA在缺氧缺血后24小时开始降低，持续到72小时仍未恢复正常，P均<0.05，(2)Western蛋白印迹方法表明PVL组新生大鼠脑白质GluR2蛋白含量在缺氧缺血后24h开始降低，72小时仍明显低于对照组，P均<0.05。 结论：随着缺氧缺血后时间的延长，GIuR2mRNA和蛋白质含量减少，GIuR2的减少可能导致脑白质细胞内钙离子超载，损伤细胞。 目的：观察新生2日龄SD大鼠脑缺氧缺血后脑白质SOD、MDA的变化，及加用托吡酯干预后对脑白质的保护作用方法：采用经右侧颈总动脉结扎加缺氧处理的2日龄SD大鼠PVL模型，分别应用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法检测缺氧缺血后12h、24h、48h、72h脑白质内SOD和MDA变化；加用托吡酯腹腔注射(30mg／kg)5个半衰期后检测MDA的改变。统计方法采用成组t检验和单因素方差分析。 结果：(1)PVL各组SOD活性明显低于相应对照组，而MDA含量明显高于相应对照组，P均<0.05。MDA在缺氧缺血后不同时间点变化趋势与缺氧缺血后细胞内游离Ca<'2+>浓度变化趋势一的萃取回收率。分析方法选用高灵敏度的GC-MS，选择离子模式检测，对水中噻唑硫磷的检测灵敏度可低至56.4 pg/ml，与噻唑硫磷具有相似结构的其他农药不会对测定产生干扰。运用该方法对施用噻唑硫磷农药后，环境水中的痕量残留进行了检测。

目录

缩略词表

前 言

第一部分三七素的结构确证及质量控制方法研究

第二部分三七素手性拆分及手性代谢研究

第三部分噻唑硫磷结构确证、质量控制及残留检查

第四部分总结

参考文献

综述生物质谱技术及其在药物分析领域的应用

致 谢

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