三种致病菌的多重PCR检测及副溶血弧菌tdh基因原核表达载体的构建

摘要

目前，微生物引起的食品安全问题受到世界各国的关注。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）被认为是三种重要的污染食品的致病菌，由这些菌引起的食物中毒事件近年来呈上升趋势。通常，对这三种菌的传统的检测和鉴定方法依赖于分离培养和生化鉴定等，但这些方法烦琐费时、耗力，且特异性不强。因此，建立快速、灵敏、特异性强的病原微生物检测方法是食品安全的当务之急。 近年来免疫学和分子生物学的发展，为食源性致病菌的检测提供了良好的技术平台。本文综述了免疫荧光抗体技术、酶联免疫技术、免疫金技术、核酸探针、多重PCR、基因芯片、生物传感器等方法，其中多重PCR因其具有高效性、特异性和简便性，因而被选择作为本研究的主要研究方法。 本研究内容分两部分，第一部分侧重于三种食源性致病菌的多重PCR检测。根据副溶血弧菌的耐热直接溶血素基因（tdh）、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）和单核细胞增生李斯特菌的侵入关联蛋白基因（iap）分别设计引物，经验证表明三对引物的特异性良好，引物间不存在交叉。以三种菌的混合DNA为模板，使用每对引物进行单重PCR扩增，分别得到了相关的目的基因片段，经克隆和序列分析，tdh、nuc和iap基因与GenBank中相关序列的同源性分别达到100％、100％和98％。在单重PCR条件的基础上，建立了对三种菌的多重PCR检测方法，并对Mg2+浓度、dNTP浓度和延伸时间等反应体系和反应条件进行优化。结果表明：三对引物能特异性地扩增出202bp、484bp和714bp的目的片段。优化后的多重PCR反应体系为：10×PCR buffer（-Mg2+）2．5μL、200μmol/L dNTP、2mmol/L Mg2+、模板2μL、2．5U Taq酶，引物浓度分别为：副溶血弧菌200nmol/L、金黄色葡萄球菌40nmol/L、单核细胞增生李斯特菌320nmol/L，总反应液25μL。反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火40s、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸15min。为检验该方法的实用性，对人工污染的贝类模拟样品进行了单重PCR和多重PCR检测，结果显示：单重PCR检测限为：副溶血弧菌2．3CFU/mL、金黄色葡萄球菌2．5CFU/mL、单细胞增生李斯特氏菌1．5 CFU/mL；多重PCR的检测限为副溶血弧菌2．3×102CFU/mL、金黄色葡萄球菌2．5×101CFU/mL、单核细胞增生李斯特菌1．5×103CFU/mL。本研究通过多重PCR技术实现了对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的一次性检出，具有快速，灵敏度高，特异性强等优点。 第二部分内容为副溶血弧菌耐热直接溶血素基因tdh的原核表达研究。通过PCR技术扩增得到tdh全长基因，将其连接克隆载体pMD18-T后进行测序分析，证实无点突变，且两端成功引入限制性酶切位点。将表达载体pET-32a与tdh用EcoRⅠ和HindⅢ分别进行双酶切后连接，经阳性克隆鉴定，成功构建了tdh的原核表达载体pET32a-tdh。为TDH蛋白的获得及抗体的制备奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 病原微生物与食品安全

1.2 我国食品微生物污染现状与安全对策

1.3 本研究涉及的三种食源性致病菌

1.3.1 副溶血弧菌简介

1.3.2 单核细胞增生李斯特菌简介

1.3.3 金黄色葡萄球菌简介

1.4 食源性致病菌的检测方法

1.4.1 食源性致病菌的免疫学检测方法

1.4.2 食源性致病菌的分子生物学检测方法

1.5 本研究的目的意义

第二章 水产品三种致病菌多重PCR检测方法的建立

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 质粒

2.1.3 主要试剂及试剂盒

2.1.4 仪器和设备

2.1.5 培养基与试剂的配制

2.2 方法

2.2.1 细菌总DNA的提取

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳

2.2.3 试剂盒纯化DNA

2.2.4 基因的克隆

2.2.5 引物设计

2.2.6 单重PCR的反应体系和条件

2.2.7 序列分析

2.2.8 多重PCR的建立

2.3 结果

2.3.1 三种菌的单重PCR结果

2.3.2 三种菌目的片段的克隆及序列分析

2.3.3 引物特异性的考察结果

2.3.4 三种菌的多重PCR检测及其反应条件的优化

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 模拟污染样品的检测

3.1 材料

3.1.1 文蛤

3.1.2 主要试剂和仪器

3.2 方法

3.2.1 菌种的扩增

3.2.2 模拟污染样品的制备

3.2.3 DNA的提取

3.2.4 模拟污染样品的单重PCR和多重PCR检测

3.3 结果

3.3.1 贝类模拟样品的单重PCR检测结果

3.3.2 贝类模拟样品的多重PCR检测结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 副溶血弧菌tdh基因的克隆及表达载体的构建

4.1 材料

4.1.1 菌种

4.1.2 质粒

4.1.3 主要试剂及试剂盒

4.1.4 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 总DNA的提取

4.2.2 引物的设计

4.2.3 副溶血弧菌tdh全长基因的获得

4.2.4 重组tdh基因的获得

4.2.5 基因tdh的双酶切

4.2.6 pET-32a的双酶切

4.2.7 重组质粒的构建

4.3 结果

4.3.1 tdh全长基因的扩增结果

4.3.2 阳性克隆的鉴定结果

4.3.3 pET-32 a-tdh重组质粒的PCR鉴定

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 研究结论

5.2 展望

参考文献

附录

致谢