用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法

摘要

本发明涉及一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法，该设计方法包括利用引物设计软件设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物组合、筛选竞争状态优势引物，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证，最后去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合，同时还公开了多重PCR的检测方法，与现有技术相比，本发明的优点在于：采用本发明建立的多重PCR的引物组合同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因，具有操作简便、快速，特异性强，灵敏度高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种用于同时检测海洋粪肠球菌、迟缓爱德华 菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪 肠球菌cylA基因的多重PCR引物及其设计方法。

背景技术

粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌，属于可以通过食物、水 进行传播的病原菌。它们的生物学特性和致病性有一定的区别，但都可以引起食物中毒和 消化系统疾病。

粪肠球菌普遍存在于自然界，可引起心内膜炎，胆囊炎，脑膜炎，尿路感染及伤口感 染等多种疾病。它对营养要求低，在普通营养琼脂上也可生长，能在10℃或45℃pH9.6 或含6.5％NaCl肉汤培养基中生长。该菌对恶劣的外环境和冷冻条件具有较强的抵抗力， 作为监测水质卫生，环境卫生质量的污染指标更具有卫生学意义。这种细菌作为一个有卫 生学意义的细菌(该菌的污染在某些食品中也常被发现)，在我国有多次出现食物中毒情 况，其中有一次与海洋食物清理不净相关。

迟缓爱德华菌属肠杆菌科，爱德华氏菌属，是引起鱼类水生动物的一种重要病原菌疾 病，也能感染人类，可导致腹泻、营养性肝硬化、低烧等症状，有溶血素、侵入上皮细胞 因子、杀伤吞噬细胞因子和软骨素酶等多种毒性因子。有该菌引起的食物中毒在新闻报道 中较少，但是由其的危害不容忽视。

肉杆菌是一种直长杆菌，在环境中多有分布，在腐败物中常有发现，在长时间暴露于 空气中的肉质品和鱼中也会发现该菌，在我国国内相关报道较少。肉杆菌是一种条件致病 菌，一般对人不会引起致病，但是分泌的一些毒素会引起人类的肠道疾病和败血症，是一 种在海洋中具备致病性的细菌。

苏云金杆菌一直被认为是一种微生物源低毒杀虫剂，对人类伤害不大，但是苏云金杆 菌和蜡状芽孢杆菌间的区别仅仅在于后者具有杀虫质粒编码，该质粒的丢失可使苏云金杆 菌转化成蜡状芽孢杆菌，而蜡状芽孢杆菌是常见的食品污染菌，能产生一种呕吐毒素和多 种肠毒素，主要引发呕吐和腹泻型食物中毒。与蜡状芽孢杆菌同属的苏云金杆菌也能产生 类似的肠毒素，近来发现它可能与食品中毒有关。我国应当加强对蜡状芽孢杆菌的监测和 研究。

溶藻弧菌与副溶血弧菌形态和生物学功能较为相似，能产生不耐热性肠毒素、耐热性 肠毒素和溶血毒素。该菌在海产品中经常出现，也是海生生物的主要致病菌，对人类具有 一定的致病性，在公共卫生学上具有重要意义。由该菌引起的食物中毒在沿海地区较为普 遍，需要与副溶血弧菌区分鉴别。

gyrB基因在细菌的分类和检测中具有鉴别作用。gyrB即促旋酶(gyrase)的B亚单位基 因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。此基因存在 于大多数细菌中，不会发生频繁的水平转移，在不同的蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸 替代率也不相同，可在细菌的系统发育学，特别是在近缘种和菌株的区分及鉴定起到重要 作用。

副溶血弧菌tlh基因是副溶血弧菌所特有的，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测 副溶血弧菌的靶基因。该基因可产生溶血素。

粪肠球菌cylA基因是与粪肠球菌致病性相关的一种毒力基因，在致病菌株中分离率 较高(高于35％)，并且与其他细菌相比，该基因部分序列同源性较低，所以可选用作为 检测致病性粪肠球菌的靶基因。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是一种体外快速扩增DNA 的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的 分子生物学技术。PCR技术的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变 性、退火(复性)、延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热 至93℃左右一段时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模 板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；③引物的延伸：DNA模板与引物的结合物在72℃，Taq DNA聚合酶的作用下， 以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模 板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性、退火(复性)、延伸三个过程就可获得更 多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多重PCR是在普通PCR 的基础上加以改造，在一个PCR反应体系中同时加入多对特异性引物，针对多个DNA模 板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR在一次反应中能同时 扩增多个目的片段的多个靶序列。该技术可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，在同 一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。多重PCR最大 的问题在于引物的设计和反应条件的优化。和一般PCR相比较，多重PCR在同一PCR反 应管内需要同时扩增出多个病原菌的目的片段，一次完成多个模板的扩增。在本发明中， 在同一反应管内检出粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟 肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因，将大大节省时间和试剂， 节约经费，为检测提供更多更准确的信息。多重PCR的引物设计要求总体上与一般PCR 的引物一致，如引物自身需要有稳定的二级结构，引物之间也不能形成发夹和引物二聚体 等。这是因为单对引物扩增单个模板都能扩增出条带清晰的目的片段，但是各种引物混和 后扩增会有条带丢失现象出现。各引物之间还存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物， 导致目的片段丢失。甚至引物之间相互作用产生严重的引物二聚体，导致目的片段丢失。

多重PCR以其快速、高效、特异性好、灵敏度高的特点，在食品病原微生物、非致 病微生物及环境微生物等检测中具有重要作用，符合口岸、卫生、质检等部分快速检测的 需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检 测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及三种细菌的毒力基因的 多重PCR势在必行。这对于加强水产品中这些致病菌的快速检验检疫、水产养殖病害的调 查和防治、无公害水产品检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有提示和警 示的作用。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海洋 中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR引物及其设计方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种用于同时检测海 洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方法，其具有简单、灵敏、快速、特 异性强的特点。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于同时检测海洋中五种致病菌以 及三种毒力基因的多重PCR引物，其特征在于：该五种致病菌以及三种毒力基因的多重 PCR引物分别包括粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠 杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物；

其中，粪肠球菌的上下游引物为：

P1：5’-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’；

P2：5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’；

迟缓爱德华菌的上下游引物为：

P3：5’-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3’；

P4：5’-TGGCGACACCGAGCAGATT-3’；

肉杆菌的上下游引物为：

P5：5’-CCATGGACAATGATTGTTG-3’；

P6：5’-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3’；

苏云金杆菌的上下游引物为：

P7：5’-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’；

P8：5’-CTTCATTACATTCAACCCAG-3’；

溶藻弧菌的上下游引物为：

P9：5’-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’；

P10：5’-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3’；

阴沟肠杆菌gyrB基因的上下游引物为：

P11：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’；

P12：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’；

副溶血弧菌tlh基因的上下游引物为：

P13：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’；

P14：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’；

粪肠球菌cylA基因的上下游引物为：

P15：5’-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’；

P16：5’-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3’；

进一步地，所述粪肠球菌引物对应的PCR扩增片段大小为1097bp，迟缓爱德华菌引 物对应的PCR扩增片段大小为708bp，肉杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为566bp，苏 云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，溶藻弧菌引物对应的PCR扩增片段大 小为159bp，阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR扩增片段大小为1250bp，副溶血弧菌 tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，粪肠球菌cylA基因引物对应的PCR扩增 片段大小为405bp。

本发明提供了一种用于同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的设计方法，其 特征在于：包括以下步骤：

步骤1，利用引物设计软件设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金 杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的 多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20-23个，引物的熔解温度 Tm值为54℃-63℃，引物的GC％为40％-60％；

步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；

步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比 较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基 数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物， 进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；

步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步 骤3进行再次判断；

步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；

步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。

本发明还提供一种同时检测海洋中五种致病菌以及三种毒力基因的多重PCR的检测方 法，其特征在于包括如下步骤：

1)细菌的初步分离：从培养基中提取基因组DNA，备作PCR模板；

2)多重PCR扩增包括：a、多重PCR扩增反应体系：取上述DNA模板1～12μL， 反应体系为20-30.0μL，各反应产物分别为TaqDNA聚合酶5U/μL，0.1-0.25μL，PCR缓 冲液2.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸混合物10mmol/L，2-3.5μL，引物P1、P2各0.5-1.0μL， P3、P4各1.0-2.5μL，P5、P6各0.75-2μL，P7、P8各1.5-4.0μL，P9、P10各0.25-0.75μL， P11、P12各0.5-1.5μL，P13、P14各0.25-0.75μL，P15、P16各0.25-0.75μL，余量用重蒸 水补足；b、扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s， 循环35次，72℃终末延伸10min；c、将步骤b的扩增产物进行电泳检测及结果分析。

作为优选，所述步骤a中引物P1、P2各0.5μL，P3、P4各1.5μL，P5、P6各1μL， P7、P8各2μL，P9、P10各0.25μL，P11、P12各0.5μL，P13、P14各0.25μL，P15、P16 各0.75μL。

附图说明

图1多重PCR鉴别粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌属、苏云金杆菌和溶藻弧菌的 的电泳检测结果；

图2多重PCR鉴别阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因 的电泳检测结果。

具体实施方式

以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

1)利用primer express2.0引物设计软件设计同时扩增粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆 菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌和阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA 基因的多重引物组合；

2)筛选多重引物组合中PCR检测粪肠球菌的引物；

3)筛选多重引物组合中PCR检测迟缓爱德华菌的引物；

4)筛选多重引物组合中PCR检测肉杆菌的引物；

5)筛选多重引物组合中PCR检测苏云金杆菌的引物；

6)筛选多重引物组合中PCR检测溶藻弧菌的引物；

7)筛选多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧 菌的引物组合；

8)筛选多重引物组合中PCR检测阴沟肠杆菌gyrB基因的引物；

9)筛选多重引物组合中PCR检测副溶血弧菌tlh基因的引物；

10)筛选多重引物组合中PCR检测粪肠球菌cylA基因的引物；

11)筛选多重PCR同时检测阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌 cylA基因的引物组合。

所述的步骤1)，其中涉及的引物参照实验室海洋分离株相应的基因序列和GenBank 上发表(E.faec.16s rRNA为GenBank AB362602、AB712374，E.tarda.gyrB为GenBank  FJ158597、KC665637，C.Coll.为GenBank AF275938，B.thur.hbl为GenBank AJ243147， V.algi.toxR为GenBank EU155576、EU155566，E.bact.gyrB为GenBank AF302677、 AY370837，V.para.tlh为GenBank GU971655、AB012596)对应的基因序列，应用primer  express2.0设计同时检测细菌和毒力基因的特异性引物组合。

备注：在本专利文本中，E.faec.为粪肠球菌的英文缩写，E.tarda.为迟缓爱德华菌的英 文缩写，C.Coll.为肉杆菌的英文缩写，B.thur.为苏云金杆菌的英文缩写，V.algi.为溶藻弧菌 的英文缩写，E.bact.为阴沟肠杆菌的英文缩写，V.para.为副溶血弧菌的英文缩写，E.faec. (16s rRNA)P1和E.faec.(16s rRNA)P2为根据粪肠球菌16s rRNA设计的上游引物P1 和下游引物P2，E.tarda.(gyrB)P3和E.tarda.(gyrB)P4为根据迟缓爱德华菌gyrB基因 设计的上游引物P3和下游引物P4，C.Coll.P5和C.Coll.P6为根据肉杆菌公布的一段基因 设计的上游引物P5和下游引物P6，B.thur.(hbl)P7和B.thur.(hbl)P8为根据苏云金杆 菌hbl基因设计的上游引物P7和下游引物P8，V.algi.(toxR)P9和V.algi.(toxR)P10为 根据溶藻弧菌toxR基因设计的上游引物P9和下游引物P10，E.bact.(gyrB)P11和E.bact. (gyrB)P12为根据阴沟肠杆菌gyrB基因设计的上游引物P11和下游引物P12，V.para.(tlh) P13和V.para.(tlh)P14为根据副溶血弧菌tlh基因设计的上游引物P13和下游引物P14， E.faec.(cylA)P15和E.faec.(cylA)P16为根据粪肠球菌cylA基因设计的上游引物P15 和下游引物P16。

所述的步骤2)、3)、4)、5)、6)和7)，经过筛选，粪肠球菌引物对应的PCR扩增片 段大小为1097bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为708bp，肉杆菌引物对应 的PCR扩增片段大小为566bp，苏云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，溶藻 弧菌引物对应的PCR扩增片段大小为159bp。具体引物序列如下：

粪肠球菌16s rRNA的上下游引物：

E.faec.(16s rRNA)P1：5’-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’；

E.faec.(16s rRNA)P2：5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’；

迟缓爱德华菌的上下游引物：

E.tarda.(gyrB)P3：5’-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3’；

E.tarda.(gyrB)P4：5’-TGGCGACACCGAGCAGATT-3’；

肉杆菌的上下游引物：

C.Coll.P5：5’-CCATGGACAATGATTGTTG-3’；

C.Coll.P6：5’-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3’；

苏云金杆菌的上下游引物：

B.thur.(hbl)P7：5’-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’；

B.thur.(hbl)P8：5’-CTTCATTACATTCAACCCAG-3’；

溶藻弧菌的上下游引物：

V.algi.(toxR)P9：5’-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’；

V.algi.(toxR)P10：5’-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3’；

所述的步骤8)、9)、10)和11)，经过筛选，阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR 扩增片段大小为1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，粪 肠球菌cylA基因引物对应的PCR扩增片段大小为405bp。具体引物序列如下：

阴沟肠杆菌gyrB基因的上下游引物：

E.bact.(gyrB)P11：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’；

E.bact.(gyrB)P12：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’；

副溶血弧菌tlh基因的上下游引物：

V.para.(tlh)P13：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’；

V.para.(tlh)P14：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’；

粪肠球菌cylA基因的上下游引物：

E.faec.(cylA)P15：5’-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’；

E.faec.(cylA)P16：5’-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3’；

所述的步骤7)和11)，多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云 金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因 方法最佳反应条件的测定，分别利用5对引物进行5种细菌模板和利用3对引物进行3种 细菌模板多重PCR最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等的测定，然后根据实验结果进行 多重PCR最佳循环次数的测定。

所述的步骤7)，多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌 和溶藻弧菌方法的反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl₂) 2.5μL，10mmol/L dNTP3μL，10mmol/L E.faec.(16s rRNA)上下游引物各0.5μL，10mmol/L  E.tarda.(gyrB)上下游引物各1.5μL，10mmol/L C.Coll.上下游引物各1μL，10mmol/L B.thur. (hbl)上下游引物各2μL，10mmol/L V.algi.(toxR)上下游引物各0.25μL，5U/μL Taq酶 0.2μL，E.bact.的DNA模板3μL，E.tarda.和C.Coll.的DNA模板各2.5μL，B.thur.的DNA 模板2μL，V.algi.的DNA模板0.5μL，ddH₂O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min； 变性94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃60s，30个循环；终延伸72℃10min；4℃保存；

所述的步骤11)，多重PCR同时检测阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪 肠球菌cylA基因方法的反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl₂) 2.5μL，10mmol/L dNTP3μL，10mmol/L E.bact.(gyrB)上下游引物各0.5μL，10mmol/L V.para.(tlh)上下游引物各0.25μL，10mmol/L E.faec.(cylA)上下游引物各0.75μL，5U/μL Taq酶0.25μL，E.bact.的DNA模板2μL，V.para.的DNA模板1.0μL，E.faec.的DNA模板 12μL，ddH₂O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火56℃30s， 延伸72℃60s，30个循环；终延伸72℃10min将以上PCR产物在0.5×TBE、2.0％琼脂 糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察。

图1显示了对粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌样品分别进 行多重和单重PCR的检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker；1号泳道为五重 PCR扩增结果，在分子量约为1097bp、708bp、566bp、458bp和159bp处分别呈现明亮目 的扩增条带，说明本实施例的样品中存在粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌 和溶藻弧菌；2号泳道为粪肠球菌的检测结果，呈现分子量约为1097bp的明亮的、单一的 扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌；3号泳道为迟缓爱德华菌的检测结果，呈现分子量 约为708bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有迟缓爱德华菌；4号泳道为肉杆 菌的检测结果，呈现分子量约为566bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有肉杆 菌；5号泳道为苏云金杆菌的检测结果，呈现分子量约为458bp的明亮的、单一的扩增条 带，说明样品中含有苏云金杆菌；6号泳道为溶藻弧菌的检测结果，呈现分子量约为159bp 的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有溶藻弧菌；7号泳道为粪肠球菌和溶藻弧菌 的检测结果，呈现分子量约为1097bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中 含有粪肠球菌和溶藻弧菌；8号泳道为粪肠球菌、肉杆菌和溶藻弧菌的检测结果，呈现分 子量约为1097bp、566bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌、 肉杆菌和溶藻弧菌；9号泳道为粪肠球菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌的检测结果， 呈现分子量约为1097bp、566bp、458bp和159bp的明亮的、特征的扩增条带，说明样品 中含有粪肠球菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌。

图2显示了对阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因样品 分别进行多重和单重PCR的检测结果，其中M号泳道为DL2000DNA Marker；1号泳道 为三重PCR扩增结果，在分子量约为1250bp、454bp和405bp处分别呈现明亮目的扩增条 带，说明本实施例的样品中存在阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA 基因；2号泳道为阴沟肠杆菌gyrB基因的检测结果，呈现分子量约为1250bp的明亮的、 单一的扩增条带，说明样品中含有阴沟肠杆菌gyrB基因；3号泳道为副溶血弧菌tlh基因 的检测结果，呈现分子量约为454bp的明亮的、单一的扩增条带，说明样品中含有副溶血 弧菌tlh基因；4号泳道为粪肠球菌cylA基因的检测结果，呈现分子量约为405bp的明亮 的、单一的扩增条带，说明样品中含有粪肠球菌cylA基因。

实施例1

利用引物设计软件Oligo6.0设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金 杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的 多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为23个，引物的熔解温度Tm 值为60℃，引物的GC％为60％；

步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；

步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比 较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基 数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物， 进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；

步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步 骤3进行再次判断；

步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；

步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。

具体引物序列如下：

E.faec.(16s rRNA)P1：5’-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’

E.faec.(16s rRNA)P2：5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’

E.tarda.(gyrB)P3：5’-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3’

E.tarda.(gyrB)P4：5’-TGGCGACACCGAGCAGATT-3’

C.Coll.P5：5’-CCATGGACAATGATTGTTG-3’

C.Coll.P6：5’-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3’

B.thur.(hbl)P7：5’-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’

B.thur.(hbl)P8：5’-CTTCATTACATTCAACCCAG-3’

V.algi.(toxR)P9：5’-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’

V.algi.(toxR)P10：5’-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3’。

E.bact.(gyrB)P11：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’

E.bact.(gyrB)P12：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’

V.para.(tlh)P13：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’

V.para.(tlh)P14：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’

E.faec.(cylA)P15：5’-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’

E.faec.(cylA)P16：5’-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3’

实施例2用于同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌 以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因的多重PCR引物设 计方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，利用引物设计软件Primer Premier5.0设计同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、 肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球 菌cylA基因的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为22个，引物 的熔解温度Tm值为54℃，引物的GC％为40％；

步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不形成引物二聚体的引物；

步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将上述所保留引物的GC％和碱基数进行比 较，当引物的碱基数均相同且内侧引物的GC％小于外侧引物的GC％，或者当引物的碱基 数不完全相同且内侧引物的碱基数比外侧引物少一个碱基时，判断为竞争状态劣势引物， 进行步骤4；否则判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；

步骤4，再次筛选竞争状态引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步 骤3进行再次判断；

步骤5，利用PCR方法对竞争状态优势引物进行扩增验证；

步骤6，去除扩增引物中的竞争状态劣势引物，获得多重PCR引物组合。

具体引物序列如下：

E.faec.(16s rRNA)P1：5’-TGCCGCATGGCATAAGAGTC-3’

E.faec.(16s rRNA)P2：5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’

E.tarda.(gyrB)P3：5’-GACTCAACGGCGGATTTCAC-3’

E.tarda.(gyrB)P4：5’-TGGCGACACCGAGCAGATT-3’

C.Coll.P5：5’-CCATGGACAATGATTGTTG-3’

C.Coll.P6：5’-CTCGAGGCAGCGAGATCTT-3’

B.thur.(hbl)P7：5’-CTATTCTCGTATGTTCATTCG-3’

B.thur.(hbl)P8：5’-CTTCATTACATTCAACCCAG-3’

V.algi.(toxR)P9：5’-GATCGTTTTGACCTGCGAAA-3’

V.algi.(toxR)P10：5’-GCATTGAGCGCTACGTGAAT-3’。

E.bact.(gyrB)P11：5’-AAGCGHCCNGSNATGTAYATHGG-3’

E.bact.(gyrB)P12：5’-CCNGCNGARTCNCCYTCNAC-3’

V.para.(tlh)P13：5’-TGAGTTGCTGTTGTTGGATGC-3’

V.para.(tlh)P14：5’-GTTGATGACACTGCCAGATGC-3’

E.faec.(cylA)P15：5’-GACTCGGGGATTGATAGGCA-3’

E.faec.(cylA)P16：5’-GCTGCTAAAGCTGCGCTTAC-3’。

实施例3

1、设计合成粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌以及阴沟肠 杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因引物

参照海洋分离株相应的基因序列和GenBank上发表的四种细菌对应的基因序列，应用 primer express2.0设计一对特异性引物，粪肠球菌引物对应的PCR扩增片段大小为1097bp， 迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为708bp，肉杆菌引物对应的PCR扩增片段 大小为566bp，苏云金杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为458bp，溶藻弧菌引物对应的 PCR扩增片段大小为159bp，阴沟肠杆菌gyrB基因引物对应的PCR扩增片段大小为 1250bp，副溶血弧菌tlh基因引物对应的PCR扩增片段大小为454bp，粪肠球菌cylA基因 引物对应的PCR扩增片段大小为405bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

具体参见表1：

2、摸索细菌模板提取方法

采用传统方法(苯酚-氯仿提取法)、热裂解法和试剂盒提取法3种方法分别对细菌DNA 进行提取，并将提取的DNA模板进行PCR扩增，对结果进行对照，选出最佳提取方法。 试剂盒提取法、热裂解法和传统提取法提取效果基本相同，效果较好。但是传统方法操作 较为烦琐，试剂盒提取法因为相对成本较高，因此最终选择热裂解法为最佳提取方法；热 裂解法具体方案如下：将粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌菌株 分别接种到Luria Broth(LB)培养基和3.5％碱性蛋白胨水中，过夜培养17小时；将培养后 菌液倒入1.5mLEp管中大约1.2mL，12000rpm离心约1min，倒去上清，再13000rpm离心 约1min，吸去残液；用无菌PBS120μL重悬沉淀，放入沸水中悬浮加热10min后，立即 冰浴5min；再放入沸水中悬浮加热5min，再冰浴5min；将冰浴后的Ep管，10000rpm离 心1min，取上清液做模板。

3、多重PCR检测方法的建立

多重PCR同时检测粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌方法的 反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl₂)2.5μL，10mmol/L脱 氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP)3μL，10mmol/L E.faec.(16s rRNA)上下游引物P1、 P2各0.5μL，10mmol/L E.tarda.(gyrB)上下游引物P3、P4各1.5μL，10mmol/L C.Coll. 上下游引物P5、P6各1μL，10mmol/L B.thur.(hbl)上下游引物P7、P8各2μL，10mmol/L  V.algi.(toxR)上下游引物P9、P10各0.25μL，5U/μL Taq酶0.25μL，E.bact.的DNA模板 3μL，E.tarda.和C.Coll.的DNA模板各2μL，B.thur.的DNA模板4μL，V.algi.的DNA模板 1.0μL，ddH₂O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s，退火56℃30s， 延伸72℃60s，35个循环；终延伸72℃10min；4℃保存；

多重PCR同时检测阴沟肠杆菌gyrB基因、副溶血弧菌tlh基因、粪肠球菌cylA基因 方法的反应体系为25μL，具体如下：10×PCR Buffer(含25mmol/L MgCl₂)2.5μL，10mmol/L  dNTP3μL，10mmol/L E.bact.(gyrB)上下游引物P11、P12各0.5μL，10mmol/L V.para. (tlh)上下游引物P13、P14各0.25μL，10mmol/L E.faec.(cylA)上下游引物P15、P16 各0.75μL，5U/μL Taq酶0.2μL，E.bact.的DNA模板2μL，V.para.的DNA模板1.0μL，E.faec. 的DNA模板3μL，ddH₂O补足至25μL。扩增条件为预变性94℃5min；变性94℃30s， 退火56℃30s，延伸72℃60s，35个循环；终延伸72℃10min；4℃保存；

将以上PCR产物在0.5×TBE、2.0％琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后 在凝胶成像系统中观察。

4、多重PCR最佳反应条件的摸索

分别用5对致病菌引物进行5种细菌模板以及3对毒力基因引物进行3种对应模板的 多重PCR最佳退火温度、引物浓度、模板浓度等测定，然后根据实验结果进行多重PCR 最佳循环次数的测定。结果测得多重PCR，退火温度为56℃-59℃均可，其中以56℃效果 最佳；10mmol/L dNTP的剂量2μL、2.5μL、3μL、3.5μL均可，最终选择3μL为最佳使用 量，因为使用量较少且条带清晰；25μL反应体系中所加的5U/μL Taq酶剂量0.25μL、0.20μL、 0.15μL、0.10μL、0.05μL，其中以0.20μL和0.25μL效果最佳，因0.20μL用量较少作为最 佳添加量；多重PCR循环次数35个均可，但35个循环次数效果明显；多重PCR反应条 件范围：10mmol/L dNTP2-3.5μL，5U/μL Taq酶0.10-0.25μL，28～35个循环次数。多重 PCR最佳反应条件：10mmol/L dNTP3μL，5U/μL Taq酶0.20μL，35个循环次数。

5、多重PCR灵敏度检测

取28℃培养18h的粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌、溶藻弧菌、阴沟 肠杆菌和副溶血弧菌菌液选择热裂解法提取各个菌体DNA模板，10倍梯度稀释后，相同 稀释度不同菌的DNA模板同比例混合，采用优化好的PCR体系进行灵敏度的检测。多重 PCR能同时检测反应体系中DNA最低浓度为粪肠球菌4.22×102pg/mL，迟缓爱德华菌 4.04×102pg/mL，肉杆菌6.14×103pg/mL，苏云金杆菌3.87×102pg/mL，溶藻弧菌 2.68×102pg/mL；阴沟肠杆菌gyrB基因3.42×102pg/mL，副溶血弧菌tlh基因2.23×102pg/mL， 粪肠球菌clyA基因5.15×102pg/mL。

6、多重PCR特异性测定

分别对副溶血弧菌、溶藻弧菌、粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌属、苏云金杆菌、 沙门氏菌、大肠杆菌等细菌DNA进行提取，利用优化多重PCR条件分别对单个细菌DNA 以及目标细菌与其他细菌的随机DNA组合进行扩增，进行扩增，以检测其特异性。结果 10个菌株中只有粪肠球菌、迟缓爱德华菌、肉杆菌、苏云金杆菌和溶藻弧菌能扩增出相应 的片段，大小分别为粪肠球菌1097bp，迟缓爱德华菌708bp，肉杆菌566bp，苏云金杆菌 458bp，溶藻弧菌159bp；阴沟肠杆菌gyrB基因1250bp，副溶血弧菌tlh基因454bp，粪肠 球菌cylA基因405bp，均与预期相符，而其它均未扩增出相应的片段。说明本研究多重 PCR方法特异性良好。

7、多重PCR稳定性测定

按照最优多重PCR条件将除模板以外的PCR反应体系混合后分装，放-20℃冻存，按 照最佳PCR反应条件定期取出检测。检测期间将预先混合好的PCR混合液放置在-20℃条 件下保存1、2、3、4、5个月仍能扩增出和现配的PCR混合液相似清晰的条带，此试验还 在进行中，最终时间还没有最终确定。但通过将近半年的检测可以看出该试剂的稳定性较 好，至少能保持5个月以上。

8、多重PCR海水样品检测

采取12份环境海水样品以及9份养殖海水样品，用多重PCR检测，同时与常规方法 检测进行比较。PCR检测结果与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。