SRF介导pol-miR-133a调控牙鲆肌肉发育的分子基础研究

摘要

牙鲆是我国重要的海水养殖经济鱼类，其典型的胚后变态发育使之成为变态发育机制的良好模型，其中肌肉发育是牙鲆变态发育中一个极其重要和复杂的生物学过程。血清应答因子（SRF）是 MADS（MCM1，AGAMOUS，DEFICIENS和SRF）框基因家族的成员之一。在真核生物中高度保守，在各组织器官中广泛表达，是生物体内重要的多功能转录因子，在细胞中以同源二聚体的形式与DNA序列CC(A/T)6GG（CArG元件）结合后，通过MAPK或RhoA途径调节下游基因的表达，它能够激活肌相关因子（Myogenin、MyoD、SM22、MLC）调控肌细胞的生长、增殖及分化等，从而影响肌肉发育及收缩功能。MicroRNA(miRNA)是一类由18～25个碱基组成的内源性非编码小单链RNA分子，通常在转录后水平上抑制靶基因的mRNA翻译或降解靶基因mRNA来发挥作用。miR-133a在肌肉组织中特异存在参与调控肌肉发育，可促进成肌细胞增殖，而抑制成肌细胞的分化。本课题组已分析了pol-miR-133a和MRFs(MyoD、Myf5、Myogenin)在牙鲆变态过程中的表达。本论文主要从SRF基因出发，克隆了牙鲆SRF基因cDNA全长，检测了其在牙鲆不同组织、胚胎和仔鱼各发育时期以及甲状腺激素和硫脲对其表达的影响；另外通过生物信息学方法和靶基因验证实验分析pol-miR-133的靶基因；然后还构建了牙鲆SRF基因的真核表达载体pEGFP-N1-SRF，检测其在牙鲆胚胎细胞中的表达以及对牙鲆肌相关因子 MRFs表达的影响。以期揭示miR-133a、SRF和MRFs三者在牙鲆肌肉发育中的关系，为进一步研究牙鲆变态机理提供理论基础。
　　本研究首先通过RACE-PCR技术，从牙鲆组织总RNA中克隆了牙鲆SRF基因全长序列，该序列全长为2477bp，包括574bp的5’非编码区（UTR）和400bp的3’UTR区，开放阅读框1503bp,编码500个氨基酸。在蛋白质同源序列比对中，牙鲆SRF的氨基酸序列与其他物种的同源性在55％-75%之间，并具有核定位信号NLS结构域和高度保守的MADS框。SRF基因的进化树分析显示牙鲆与红鳍东方鲀和青斑河鲀的进化关系较近，位于鱼类的分支上。牙鲆SRF基因和其它物种的相似性，说明其在功能上是保守的。
　　利用Real-time PCR检测了牙鲆SRF基因的表达情况，结果显示牙鲆SRF基因在成鱼各组织以及胚胎仔鱼各发育时期均表达，在各组织（脑、肌肉、心脏、肾脏、鳃、胃、肝脏以及肠)表达中，肾脏和胃中表达较高，而在心脏和肝中表达量相对较低。在胚胎时期高表达，这与SRF在胚胎发育中参与中胚层的形成有关；在仔鱼阶段，3dph和7dp h表达量最低，这同SRF与分化作用有关而与增殖作用无关想符合；而后表达量逐渐升高直到14dph达到最高点，推测是在为牙鲆变态期需要大量基因表达调控，这些基因需要转录因子 SRF来激活而做准备，在17dph到36dph变态期表达相对较稳定，而在变态结束(41dph)又下降到较低的水平。
　　外源甲状腺激素（thyroid，TH）能够诱导牙鲆提前变态，而硫脲（thiourea，TU）则可以使其变态停滞。本实验通过Real-time PCR和Western blot实验检测TH和TU处理变态期仔鱼后牙鲆SRF mRNA和蛋白的表达情况，结果发现，甲状腺处理组与对照组相比除17dph时表达量降低，而在其它时期表达量都没有明显的变化；在硫脲处理组，SRF的表达量都下降，尤其是在29dph，36dph和41dph显著降低；在TH拯救实验中，TU-TH处理组与TU处理组相比，SRF mRNA的表达水平显著上调；结果表明甲状腺激素间接影响牙鲆 SRF基因的表达。
　　本实验利用靶基因预测数据库 TargetScan、miRBase等对pol-miR-133a的靶基因进行预测,筛选出与肌肉发育相关的基因SRF、WHSC和Cdc42，将这三个基因包含靶位点的3’UTR连接到pmir-G LO双荧光素酶报告基因载体中构建重组质粒以及定点突变质粒，转染牙鲆胚胎细胞进行双荧光素酶活性检测，结果显示，pol-miR-133a抑制SRF、WHSC和Cdc423’UTR双荧光素酶重组质粒表达的荧光素酶活性，对突变质粒的荧光素酶活性没有抑制效果。说明SRF、WHSC和Cdc42是pol-miR-133a的靶基因，推测在牙鲆中pol-m iR-133a调控肌肉细胞增殖可能是通过这些靶基因实现的。
　　为进一步研究牙鲆SRF基因的功能，本实验通过PCR方法扩增基因SRF的编码区片段，克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-N1-SRF重组质粒，将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞，在荧光显微镜下观察到转染细胞有绿色荧光蛋白表达，荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实，SRF在转染细胞中高表达，说明真核表达载体构建及转染成功。通过转录因子结合位点预测软件预测牙鲆MyoD、Myogenin、Myf5基因的启动子中均存在SRF转录因子结合位点，Real-time PCR检测胚胎细胞转染重组质粒后对牙鲆MRFs(MyoD、Myf5、Myogenin)基因的表达起正调控作用，说明牙鲆SRF极有可能是通过结合MRFs基因启动子序列激活其表达来调控肌肉的发育进而影响牙鲆变态，但具体作用仍需在体内做进一步的验证。
　　总之，本研究分析了SRF在牙鲆各组织和发育时期的表达谱，以及外源甲状腺激素对SRF在牙鲆变态时期的影响，预测SRF在牙鲆发育中起着重要的作用；初步验证了牙鲆中SRF、WHSC和Cdc42是pol-miR-133a的靶基因；通过构建真核表达载体分析了SRF可以促进肌相关因子MRFs(MyoD、Myf5、Myogenin)的表达。从而，初步探讨了牙鲆中SRF与miR-133a、MRFs的关系，为进一步研究SRF介导pol-miR-133a在牙鲆肌肉发育中的作用提供了基础资料。

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引言

1. 牙鲆概述

2. SRF研究概况

3. MicroRNA研究概述

4. 研究目的与意义

第一章 牙鲆SRF基因的克隆及表达

1 .1 实验材料与试剂

1. 2 实验方法

1. 3 实验结果

1.4 讨论

第二章 Pol-mir-133a靶基因预测及验证

2. 1 实验材料与试剂

2.2 实验方法

2. 3 结果

2. 4 讨论

第三章 牙鲆SRF基因真核表达载体的构建以及鉴定

3.1 实验材料与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

小结

参考文献

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