放射线诱导定向基因治疗阻断肺放射性纤维化的体内实验研究

摘要

放射性肺纤维化是胸部肿瘤病人放射治疗后常见的并发症，至今仍缺乏理想的治疗手段。随着对放射性肺纤维化发病机制的深入研究，以及分子生物学的快速发展，基因治疗有望成为新的治疗肺纤维化的有效手段。目前认为，放射性肺纤维化是多种细胞因子参与的，多细胞多系统的作用结果，其中转化生长因子B(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是目前公认的最重要的细胞因子之一。Smad7是TGF-β细胞内信号传导的阻抑因子。已有实验证明外源性Smad7基因阻断TGF-β信号传导通路，能够明显抑制博莱霉素所致的肺纤维化。但是，在机体内TGF-β广泛存在，生理作用多样而复杂，如果广泛阻断其信号传导通路，可能会产生一系列的病理生理变化，对机体造成不良影响。因此如何靶向性阻断TGF-β的信号传导通路是基因治疗肺纤维化能否应用于临床的关键因素。 早期生长反应因子(earlygrowthresponse．1，Egr-1)是一种具有辐射诱导基因表达特性的基因启动子。利用Egr-1的这一特性，若能将Egr-1的基因启动子与Smad7目的基因一起整合到腺病毒载体中，感染小鼠，经放射线照射后，激活Egr-1基因启动子，使其在放射区域内调控下游Smad7基因的高表达，区域性阻断TGF-β的作用通路，可能对放射性肺纤维化产生靶向性基因治疗的作用。这方面的研究，国内外尚未见报道。 本研究将放射性敏感性元件Egr-l基因启动子和目的基因Smad7cDNA串联整合到腺病毒载体内，构建成重组腺病毒(AD．Egr-Smad7)：选择C57BL小鼠为研究对象，经由气管内给药后制备放射性肺纤维化模型，研究外源性Smad7基因放射区域内靶向性阻断TGF-β信号传导通路，从而定向基因治疗放射性肺纤维化的机制及疗效，并从重组腺病毒对肿瘤的生物学行为影响的角度，探讨其安全性。本研究系临床前的动物实验研究，为未来开发临床上放射性肺纤维化的新的治疗手段提供理论依据。 研究C57BL小鼠对气管内途径给AD．Egr-Smad7的耐受性；探讨外源性Smad7基因在肺组织细胞内表达的定位，表达与放射剂量、放射后时相及重组腺病毒滴度的关系；观察辐射诱导AD．Egr-Smad7抑制小鼠放射性肺纤维化模型的肺纤维化发生的疗效并探讨其作用机制；观察AD．Egr-Smad7是否具有促进小鼠Lewis肺癌生长及发生肺转移的潜在危险性，确定重组腺病毒定向基因治疗放射性肺纤维化的安全性。 将Egr-1基因启动子的放射敏感元件和目的基因Smad7cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内，制备成重组腺病毒AD．Egr-Smad7。动物采用8—10周龄雄性C57BL／6J小鼠，随机分组。气管内给药24小时后，以Y射线全胸腔放射。小鼠气管内给不同滴度的重组腺病毒，通过观察急性反应及死亡情况来确定小鼠对重组腺病毒的安全耐受滴度范围：通过免疫组织化学方法，研究辐射诱导后外源性Smad7基因肺组织细胞内表达的定位。采用Westernblot印迹法检测不同放射剂量、放射后不同时间及不同重组腺病毒滴度时小鼠肺组织外源性Smad7蛋白的表达，探讨辐射诱导后其表达与放射剂量、放射后时相间及重组腺病毒滴度的关系。于放射后不同时间，用ELISA法检测肺组织内TGF-p1、CTGF、I型及II工型胶原含量；比色法测定羟脯氨酸含量；光镜下病理组织学观察肺泡炎及肺纤维化程度，研究辐射诱导AD．Egr-Smad7定向基因治疗放射性肺纤维化的疗效，并探讨其作用机制。观察AD．Egr-Smad7对Lewis肺癌荷瘤小鼠模型肿瘤生长曲线、肿瘤生长延迟时间、小鼠生存时间及肺部转移发生情况的影响，确定AD．Egr-Smad7是否具有促进肿瘤生长及发生肺转移的潜在危险性，证明重组腺病毒定向基因治疗放射性肺纤维化的安全性。 1．Y射线照射可明显诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达(oR=0．2，P=0．0000，P<0．01)。重组腺病毒滴度在109pfu及以下时，小鼠可安全耐受，各组小鼠均存活，而重组腺病毒滴度在5×109pfu及以上时，每组6只小鼠中有5只以上死亡。免疫组织化学检测结果显示外源性Smad7基因在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及细支气管上皮细胞胞浆内均有明显表达，而各对照组未见表达。2．外源性Smad7基因表达随重组腺病毒滴度升高而增加，统计学检验显示差异有显著统计学意义(PO．05；空白组与NS组比较P=0．7203，P>0．05。肿瘤体积生长至放射前4倍时AD．Egr-Smad7组与空白组比较P=0．5610，P>0．05；空白组组与NS组比较P=I，P>0．05)。 1．以腺病毒为载体，辐射诱导Egr-1启动子能够调控外源性Smad7基因在小鼠肺组织各种细胞胞浆内广泛表达，在作用场所上有阻断TGF-β信号传导通路，靶向性基因治疗放射性肺纤维化的可能性：重组腺病毒滴度在109pfu及以下时，小鼠可安全耐受。2．辐射诱导后，外源性Smad7基因的表达随重组病毒滴度升高而增加，并与放射剂量及放射后间隔时间有关，辐射诱导外源性Smad7基因的表达具有一定的稳定性及规律性。3．辐射诱导后，Egr-1启动子调控的外源性Smad7基因靶向性阻断TGF．B信号传导通路，一定程度上能够实现定向阻断放射性肺纤维化发生的作用。4．辐射诱导后，外源性Smad7基因无促进小鼠Lewis肺癌肿瘤生长及发生肺转移的危险性，并且有延长肿瘤生长延迟时间及生存时间的作用。从对肿瘤的生物学行为影响方面来说，重组腺病毒用于阻断TGF．B信号传导通路，靶向性基因治疗放射性肺纤维化具有一定的安全性。5．本研究为临床放射性肺纤维化提供了新的靶向性基因治疗可能，值得进一步深入研究。

目录

缩略简称

前 言

第一部分AD.Egr-Smad7气管内给药C57BL小鼠的耐受性及外源性Smad7基因肺部表达细胞内定位的研究

第二部分外源性Smad7在C57BL小鼠肺内的表达与放射剂量、放射后时相及重组腺病毒滴度的关系的研究

第三部分AD.Egr-Smad定向基因治疗放射性肺纤维化的体内实验研究

第四部分外源性Smad7基因对C57BL小鼠Lewis肺癌肿瘤生长及肺转移发生的影响的研究

附 录:实验中常用设备,材料与试剂

全文小结

后记(一)致谢

后记(二)发表综述及学术论文

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