雪旺氏细胞和神经干细胞共移植治疗帕金森病动物模型的实验研究

摘要

PD是一种锥体外系疾病，主要病理改变为中脑黑质多巴胺神经元进行性变性坏死，黑质纹状体通路受损，从黑质转运到纹状体的多巴胺含量减少，从而引起静止性震颤、肌强直、运动障碍等临床症侯群。根据黑质纹状体解剖学特点及多巴胺能神经元在纹状体区神经末梢的作用方式，在此区移植有分泌多巴胺功能的细胞使之成为一种有功能的“生物微量泵”，恢复纹状体内多巴胺的含量，从而达到长期治疗的效果。目前已有300多例阳患者接受了NSCs移植，但疗效不肯定。在非对照临床试验中，神经干细胞移植治疗PD的大部分患者都取得了一定的疗效，而且尸解也证明移植物中多巴胺神经元存活，但临床上个体差异大。最近二组临床双盲对照实验也证明，移植治疗在不同的年龄以及疾病严重程度之间存在着差异。因此最理想的移植方法是，移植物既能保持一定数量长期在体内存活产生多巴胺，而且能分泌各种营养因子改善移植区的营养状况，阻止PD进行性恶化，从而达到治愈PD的目的。本实验首先讨在体外研究SCs是否对纹状体的生长产生影响，然后我们利用超顺磁氧化铁(superparamagneticironoxide，SPIO)标记NSCs，对PD大鼠进行脑内移植治疗，应用MR成像观察移植后NSCs的分布和迁徙情况，最后分别用大鼠和猴的PD模型来研究雪旺氏细胞和中脑神经干细胞共移植治疗PD疗效。 第一部分：雪旺氏细胞对共培养不同发育阶段大鼠纹状体生长的影响 目的：观察雪旺氏细胞(SCs)在体外对纹状体生长的影响。 方法：将SD新生鼠SCs分别与胎鼠、新生鼠及成年鼠的纹状体在体外进行共培养，分别在3天，1、2、3、4周进行观察纹状体周围神经突起的生长及细胞的迁移情况。 结果：共培养组中，胎鼠纹状体周围在第3天就出现了神经突起的生长，第3周达到高峰；新生鼠纹状体周围在第1周出现了神经突起；成年鼠纹状体在第2周出现神经突起的生长。共培养组中，胎鼠纹状体周围第1周出现细胞的迁移，随后逐步增多；新生鼠纹状体周围第2周出现细胞的迁移；成年鼠纹状体在第3周出现少量的细胞迁移，但与对照组比较仍有统计上的差别(P<0．05)。 结论：SCs在体外能促进共培养不同发育阶段纹状体神经突起的生长及细胞迁移，可用于神经退行性疾病的移植治疗。 第二部分超顺磁氧化铁标记中脑神经干细胞移植治疗大鼠帕金森的实验研究 目的：研究应用超顺磁氧化铁(SPIO)标记神经干细胞(NSCs)移植治疗帕金森大鼠后的在体磁共振成像(MRI)观察。 方法：分离培养胚胎14-16天大鼠中脑NSCs，脂质体转染法将SPIO标记NSCs；制作大鼠帕金森氏病(PD)大鼠模型，SPIO标记的NSCs移植到PD大鼠右侧纹状体区，应用MRI在体观察脑内移植的神经干细胞的存活和迁徙情况。 结果：体外SPIO标记的神经干细胞球和由SPIO标记NSCs分化而来的细胞普鲁氏蓝染色阳性；脑内移植SPIO标记NSCs的PD大鼠磁共振T2和T2*GRE扫描检查显示在移植区呈低信号改变。而且随着时间的延长，移植区信号向周围扩大。纹状体区脑组织的铁染色也可见SPIO标记NSCs从移植部位向四周迁移。 结论：SPIO可以用来标记NSCs，对NSCs的增殖和分化无明显影响，通过MRI可以在体观察脑内移植SPIO标记的NSCs的分布和存活情况，有利于NSCs移植治疗PD后的疗效观察。 第三部分雪旺氏细胞和神经干细胞共移植治疗大鼠帕金森病的实验研究 目的：研究雪旺氏细胞(chwanncells，SCs)和神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)共移植治疗大鼠帕金森病(Parkinson'smsease，PD)的疗效。 方法：18只PD模型的SD大鼠随机平均分成3组：对照组、NSCs组及共移植组。PBS、NSCs及SCs加NSCs分别植入PD大鼠右侧纹状体内。、NSCs来源于孕13-16天胎鼠中脑腹侧的脑组织，SCs来源于l～3dSD新生鼠的坐骨神经。 结果：移植10周后NSCs组及共移植组中纹状体区都出现TH染色阳性的神经元，与NSCs组相比，共移植组中的神经元细胞体积及细胞核均较大，细胞的数量多(PO．05)。 结论：SCs和NSCs共移植能有效的治疗PD，这样既移植了能分泌多巴胺的NSCs，又移植了能分泌各种神经营养因子的SCs，改善了移植区NSCs的生存环境，从而提高了移植区多巴胺神经元的存活率。 第四部分雪旺氏细胞和神经干细胞共移植治疗恒河猴帕金森病的实验研究 目的：用灵长类猴进一步验证雪旺氏细胞(SCs)和人胚神经干细胞(NSCs)共移植治疗帕金森病(PD)猴模型的疗效，从而为临床前期实验做准备。 方法：采用恒河猴自体SCs和人胚NSCs共同移植治疗PD猴，3只成年恒河猴偏侧部分损伤性PD模型采用3种不同的移植物，对照猴移植PBS，干细胞猴移植入胚NSCs，共移植猴移植SCs+NSCs。同时结合猴行为学、PET及脑组织的免疫组化来验证细胞移植的疗效。 结果：猴行为学评分：在移植术后1月，共移植猴中的各项指标有不同程度的恢复，而干细胞猴及对照猴无明显变化；2月后，干细胞猴及共移植猴，恢复程度都在2分以上，表明移植有效；至术后4月时，已接近正常。PET示DAT的显像剂18F-FP-B-CIT，在移植后2月，共移植猴在正常侧(左侧)纹状体区呈明显的放射性浓聚，而在毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取也出现明显浓聚，干细胞猴毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取仍不明显；在移植后6月，共移植猴和干细胞猴，DAT的显像剂在毁损侧(右侧)纹状体区放射性摄取都出现明显的浓聚，而对照猴仍无明显变化。移植区脑组织TH染色显示，对照组中未见到TH阳性细胞，NSCs组可见到有TH染色阳性细胞从移植区向周围迁移；而共移植组可见到TH染色阳性细胞从移植区向周围迁移的数量明显增多，且细胞体积也较饱满。 结论：本部分实验进一步证明SCs和NSCs共移植能有效的治疗PD猴模型，SCs可来源于患者自体的周围神经，可以避免排异反应及伦理道德问题，可望在临床上推广应用。

目录

英文缩略词表

前言

第一部分 雪旺氏细胞对共培养不同发育阶段大鼠纹状体生长的影响

第二部分 超顺磁氧化铁标记中脑神经干细胞移植治疗大鼠帕金森的实验研究

第三部分 雪旺氏细胞和神经干细胞共移植治疗大鼠帕金森病的实验研究

第四部分 猴自体雪旺氏细胞和人胚神经干细胞共移植治疗恒河猴帕金森病的实验研究

全文小结

文献综述

附 录

致 谢