兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

摘要

兔出血症(Rabbit haemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一种急性、败血性、高度致死性传染病。该病于1984年在中国首次发现，其后在世界其它地区相继发生，给养兔业造成了巨大的经济损失。 鉴于RHD病程短、致死率高等特点，临床检测和早期诊断中对检测方法除要求敏感、准确外，还要求其快速化、简单化。现有的血清学检测方法因为商业养殖中对兔的严格免疫导致其无法判定是病毒感染还是疫苗免疫造成了抗体水平的升高而失去了其诊断意义。因此，在RHD的诊断中病原学检测发挥着主导作用。目前，已建立了多种实验室检测方法，其中琼脂扩散、血凝/抑制试验应用较广但灵敏性较低；反转录一聚合酶链式反应(RT-PCR)因仪器、试剂和操作技术要求更适合于实验室操作，相比之下酶标抗体技术操作相对简单又无需太多实验设备，比较适合在临床和检测中推广。然而迄今为止，只有国外少数公司研制成功了抗原检测ELISA试剂盒，其昂贵的成本使其在进行大规模临床检测时难以广泛应用。因此，研制灵敏、快速、操作简便的抗原检测ELISA试剂盒对于RHD的诊断和疫情防制具有重要意义。 本试验以分离纯化的地方毒株RHDV-TP株免疫BALB/c小鼠，制备了多株针对RHDV的单克隆抗体，对其生物学特性进行分析鉴定后，筛选出一株效价高、亲和力强的单克隆抗体DE<,2>株，并将其作为诊断试剂，建立了RHDV抗原捕获ELISA检测方法。 由于RHDV缺乏体外繁殖系统，本试验将RHDV-TP毒株攻击健康大白兔增殖病毒，发病死亡后采集其肝脏组织匀浆处理，以蔗糖密度梯度离心法纯化RHDV全病毒粒子，并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠。以真核表达系统表达的RHDV结构蛋白-VP60作为基础建立间接ELISA检测方法进行单抗筛选。通过融合与克隆过程，筛选出6株针对RHDV的单克隆抗体AD<,4>、AG<,10>、BC<,9>、BE<,8>、BH<,3>、DE<,2>；其腹水效价介于1：400～1：3×10<'4>之间。竞争相加ELISA及Western-blot试验结果表明，6株单抗分别针对5个RHDV抗原位点，其中DE<,2>株针对线性抗原位点，DE<,2>株效价较高、亲和力强，有作为诊断试剂进行开发利用的前景。 将DE<,2>株单抗腹水纯化后作为捕获抗体包被酶标板，建立了抗原捕获ELISA诊断方法检测RHDV，并对各工作条件进行了优化，筛选出最佳工作体系，然后以对已知阳性抗原样品和阴性抗原样品及临床可疑样品进行检测，并与常规血凝/血凝抑制试验检测结果进行比对。结果显示对于已知阳性样品，捕获ELISA阳性检出率为100％；对于临床可疑样品，捕获ELISA阳性检出率为62.7％，常规血凝试验为55.2％，检出率比HA高7.5％，灵敏度为HA试验的3～13倍。最低病毒检出量测定试验表明，抗原捕获ELISA诊断方法对全病毒的最低检出浓度为26ng/mL，具有很高的灵敏度。上述结果表明，基于DE<,2>株单克隆抗体的抗原捕获ELISA诊断方法可特异性地检测出发病兔肝脏组织中的RHDV，该方法快速、灵敏、准确，能够同时进行大规模的样品检测，省时省力且成本较低，是一种理想的RHDV抗原检测方法。另外，本试验制备的其他单克隆抗体分别针对不同的RHDV抗原表位，今后将对RHDV抗原表位筛选、RHDV的鉴别诊断等相关领域的研究中发挥重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章兔出血症研究进展

1.1病原研究

1.1.1病毒的分类

1.1.2病毒的形态

1.1.3 RHDV的基因组研究

1.1.4 RHDV的结构蛋白与非结构蛋白

1.2 RHD的流行病学

1.2.1易感动物

1.2.2传播途径

1.2.3流行状况

1.3 RHD的诊断

1.3.1病毒的分离与鉴定

1.3.2实验室诊断

1.4 RHD的防控及新型疫苗的研究

1.4.1基因工程亚单位疫苗

1.4.2重组病毒活载体苗

1.5小结

第二章单克隆抗体技术的发展及应用

2.1单抗技术的基本原理

2.2单克隆抗体的生产过程

2.3单克隆抗体技术研究进展

2.3.1人源化单克隆抗体

2.3.2全人化抗体

2.4单克隆抗体生产技术的进展

2.5单抗在动物病毒性传染病方面的应用

2.5.1单抗对病毒抗原结构与抗原表位的研究

2.5.2单抗在免疫学诊断上的应用

2.5.3单抗在抗病毒感染方面的应用

2.6 RHD单克隆抗体研究及应用

2.7 小结

第三章兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

3.1材料

3.1.1毒株与细胞

3.1.2实验动物

3.1.3主要试剂

3.1.4主要仪器

3.2方法

3.2.1抗原制备及纯化

3.2.2免疫小鼠

3.2.3 SP2/0细胞准备

3.2.4饲养层细胞制备

3.2.5免疫脾细胞

3.2.6细胞融合

3.2.7间接ELISA检测方法建立

3.2.8杂交瘤细胞筛选及克隆

3.2.9小鼠腹水的制备及纯化

3.2.10单克隆抗体特性鉴定

3.3结果

3.3.1纯化RHDV免疫电镜

3.3.2小鼠免疫水平

3.3.3杂交瘤细胞制备

3.3.4单克隆抗体亚类鉴定

3.3.5单抗效价测定

3.3.6腹水中单抗HI活性测定

3.3.7杂交瘤细胞染色体数分析

3.3.8杂交瘤细胞稳定性

3.3.9 McAb抗原识别位点分析

3.3.10单抗的SDS-PAGE分析

3.3.11单抗特异性Western-blot鉴定

3.4 讨论

第四章抗原捕获ELISA检测兔出血症病毒的研究

4.1材料

4.1.1主要试剂

4.1.2病毒和抗体

4.1.3材料与仪器

4.2方法

4.2.1 RHDV多克隆抗体制备

4.2.2 RHDV单克隆抗体制备

4.2.3单抗及多克隆抗体纯化

4.2.4 RHDV抗原样品

4.2.5抗原捕获ELISA方法的建立：

4.2.6抗原捕获ELISA工作条件的优化

4.2.7判定标准

4.2.8兔出血症抗原捕获ELISA检测方法性能评价

4.3结果与分析

4.3.1抗体与抗原对照样品的制备

4.3.2抗原捕获ELISA方法的建立

4.3.3抗原捕获ELISA工作条件的优化

4.3.4兔出血症抗原捕获ELISA检测方法性能评价

4.4讨论

结论

参考文献

致谢

个人简介