三角褐指藻和微拟球藻EPA合成的去饱和酶研究

摘要

本实验选择了两种海洋真核微藻-三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和微拟球藻(Nannochloropsis oculata)进行EPA合成途径中去饱和酶的研究。这两种藻均富含EPA，含量可达总脂肪酸的30％以上，说明在这两种藻中存在高效合成EPA的酶系，有望克隆得到具有较高底物特异性和酶活性的去饱和酶基因。此外，这两种藻均能够进行大规模培养，本身就可作为：EPA的来源。二者在脂肪酸合成上也存在一些差异，如三角褐指藻的EPA合成途径比较复杂，推测存在4条通路，而微拟球藻的相对简单，只有经典的n6、n3途径；除EPA外，三角褐指藻还含有少量DHA，而微拟球藻不含DHA。弄清楚存在这些差异的原因有助于对这两个藻种进行比较研究。目前对这两种藻的研究程度也不尽相同，对三角褐指藻的研究较为深入，已有4个去饱和酶基因被克隆鉴定，该藻的基因组测序及注释工作也即将完成；对微拟球藻的研究较少，分子信息相当缺乏，还没有去饱和酶的研究报道。通过分析已有资料，本实验在进行这两种藻的去饱和酶基因克隆时采取了不同的研究方法。已知三角褐指藻的4条EPA合成途径均需要△5脂肪酸去饱和酶的作用，可见△5位去饱和是EPA生成的关键步骤。先前已有研究者克隆得到一个△5去饱和酶基因(PtD5)，表达后发现能将13.3％的ETA(20：4．△8，11，14，17)转化为EPA(20：5A5,8，11，14，17)，而在藻细胞中这一转化效率几乎为100％。为什么会出现这种差异昵?推测藻细胞中至少还存在一个△5去饱和酶。通过应用简并PCR、反向PCR及RACE等方法，在三角褐指藻中成功克隆得到一个类△5去饱和酶基因序列(PtD5-2)。全基因序列共1561bp，在第303～432位碱基之间有一个内含子，转录后的mRNA翻译区有143lnt，可翻译为476个氨基酸残基。分析显示翻译后的蛋白序列具有“前端”去饱和酶的明显特征，如N端细胞色素65结构域；3个极为保守的组氨酸簇(分别为HDANH、HWTHH、QVEHH)，第3个组氨酸簇的第1个H被Q替代。此外，具有4个明显的跨膜α螺旋区，分别位于132～148、153～172、256～274．和334～352位氨基酸残基之间。将该序列在NCBI BLAST中做Protein-Protein BLAST，结果与三角褐指藻的第1个Δ5去饱和酶(PtD5)及海链藻的△5去饱和酶(DesO)同源性最高(Idemity分别51％和47％)。关于该酶的功能鉴定工作正在进行中。 微拟球藻脂肪酸合成方面的资料较少，到目前为止还没有从该藻中克隆得到去饱和酶基因的报道，而且该藻的其它分子信息也相当缺乏。鉴于微拟球藻重要的生态及经济价值，获取更多的基因信息从而对其进行深入研究是必需的。生成表达序列标签fESTs)是得到表达基因信息的有效途径，本实验选择了EPA含量较高的指数生长末期的藻细胞，构建了微拟球藻的cDNA文库并进行了大量的EST测序，以期在分子水平上对该藻有更为全面的了解，并试图从中获得EPA合成相关的去饱和酶基因。试验共获得5315条EST序列，长度100—716 bp，非冗余序列(non-redundant sequences，NRSs)1960条，其中仅有32．5％的NRSs与nr库中的蛋白序列具有相似性(E

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第一章综述

第二章三角褐指藻类△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆及序列分析

1前言

2研究方法与结果

2.1三角褐指藻的分类地位、形态特征、藻种培养及分离鉴定

2.2三角褐指藻类△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆

2.3三角褐指藻类△5脂肪酸去饱和酶的基因及蛋白序列分析

2.4三角褐指藻类△5脂肪酸去饱和酶与其它去饱和酶序列比较

3讨论

第三章微拟球藻ESTs分析及其去饱和酶的初步研究

1前言

2研究方法与结果

2.1微拟球藻的分类地位、形态特征、藻种来源及培养

2.2微拟球藻cDNA文库的构建

2.3 EST测序及生物信息学分析

2.4微拟球藻△5/ω3去饱和酶基因克隆初探

3讨论

第四章PtD5和PtD5-2基因在三角褐指藻不同生长期的表达情况及与EPA合成的关系

1研究方法

1.1试剂与仪器

1.2试验步骤

2试验结果

2.1藻细胞生长曲线

2.2定量PCR结果

2.3脂肪酸分析结果

3分析与讨论

工作总结及展望

参考文献

附录

专利及发表文章情况

致谢