刺参(Apostichopus japonicus)在氨氮胁迫下解毒代谢途径与生理健康评价技术的研究

摘要

氨氮是养殖水环境中重要的污染胁迫因子。本文通过研究刺参在氨氮胁迫下解毒代谢相关基因的表达分析、酶活性和含氮化合物含量变化,以及免疫和抗氧化指标的变化情况,初步探讨了刺参在氨氮胁迫下的解毒代谢机制和生理健康水平,主要包括三方面内容:
　　(1)刺参谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)基因片段的克隆和序列分析;
　　(2)刺参在氨氮胁迫下体内氨转运和代谢途径的研究;
　　(3)氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化指标的影响。主要结果如下:
　　1刺参氨氮解毒代谢相关基因片段的克隆和序列分析
　　本文以刺参呼吸树为模板,利用COEDHOP网站和Primer Premier5.0设计简并引物,通过RT-PCR扩增技术,克隆了刺参GDH基因和GS基因的部分序列。其中,GDH基因片段长693bp,编码231个氨基酸,通过氨基酸同源性分析发现其与点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)的相似性最高,为78％,GeneBank注册号为 KJ839834;GS基因片段长636bp,编码212个氨基酸,其与普通海胆(Paracentrotus lividus)的相似性最高,为78%,GeneBank注册号为KJ839835。
　　2刺参在氨氮胁迫下体内氨转运和代谢途径的研究
　　本实验梯度设置为:对照组(自然海水--0.01mg/L)、0.5mg/L、1.25mg/L处理组,取样时间为0、2、6、12、24和48h,分别取刺参的体腔液、呼吸树和体壁等组织,测定谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)活力、谷氨酰胺(Gln)含量和黄嘌呤氧化还原酶(XOR)活力、尿酸(UA)含量、精氨酸酶(Arg)活力、尿素(Urea)含量以及关键基因表达水平等指标。结果表明:氨氮胁迫对刺参体腔液氨氮含量和呼吸树、体壁和体腔液的GDH、GS活力、Gln含量、XOR活力、Arg活力、Urea含量以及呼吸树GDH、GS、XOR、Arg基因表达影响显著(P<0.05),而对照组无明显差异,其中各组织 UA含量和体腔液 XOR活力均未检测出。各染毒处理组体腔液氨氮含量在24h内呈峰值变化,于6h达到最大值,24h后保持稳定,并显著高于对照组水平(P<0.05)。各处理组呼吸树GDH活力、GDH mRNA表达和GS活力、GS mRNA表达、Gln含量分别在12、24h内逐渐升高,之后趋于稳定(P<0.05);体壁 GDH活力在实验时间内呈峰值变化,于12h时达到最大值,48h时恢复至对照组水平,而GS活力、Gln含量在12h内逐渐升高,12h后保持稳定(P<0.05);体腔液GDH活力在12h内逐渐升高,然后保持稳定(P<0.05),而 GS活力、Gln含量在实验时间内无显著变化。呼吸树Arg活力、Arg mRNA表达和Urea含量在12h内逐渐升高,之后保持稳定(P<0.05),而体壁XOR、Arg活力和Urea含量在48h内呈峰值变化,分别于6、12和12h达到最大值,48h时恢复至对照组水平;呼吸树XOR活力、XOR mRNA表达和体腔液 Arg活力、Urea含量与对照组均无显著差异。由此说明,刺参体内具有氨氮的解毒代谢途径,可以通过将氨氮转化为Gln和Urea来降低氨氮对机体的毒害作用。
　　3氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化指标的影响
　　实验设0、0.5和1.25mg/L氨氮处理组,0、2、6、12、24、48h取样,测定了刺参体腔液总体腔细胞数、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性,以及体腔液和体壁的总抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)活力,还原型谷胱甘肽(GSH)含量以及还原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)。结果表明,氨氮胁迫对刺参体腔液总体腔细胞数量、凝集活性、溶菌活性、抗菌活性,以及体腔液和体壁的T-AOC能力,SOD活力,GSH含量以及GSH/GSSG等指标影响显著。各处理组中,总体腔细胞数量在12h内显著降低,之后逐渐上升并恢复至对照组水平;溶菌活力则在6h内逐渐升高,之后迅速下降至对照组水平;溶菌活力和凝集活力则呈不同程度的下降趋势。体腔液T-AOC能力、SOD活性、GSH含量随胁迫时间的延长其活性显著下降,于12h后保持稳定并显著低于对照组水平;体壁T-AOC,SOD活性则在6h内迅速上升并显著高于对照组水平,之后逐渐下降,至48h时显著低于对照组水平;GSH含量以及GSH/GSSG在6h时上升至最大值,之后逐渐恢复至对照组水平。由此说明,氨氮胁迫对刺参免疫和抗氧化系统产生影响,并且长时间的氨氮胁迫可以导致刺参免疫水平和抗氧化水平降低。

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第一章 文献综述

1 养殖环境中氨氮的来源和危害

2 水产动物在氨氮胁迫下解毒代谢途径的研究进展

2.1 水产动物体内氨氮转运途径的研究进展

2.2 水产动物体内氨氮代谢途径的研究进展

3 棘皮动物生理健康评价技术的研究进展

3.1 棘皮动物免疫防御机制的研究进展

3.2 棘皮动物抗氧化防御机制的研究进展

3.3 棘皮动物生理健康评价技术

4 结语

第二章 刺参氨氮解毒代谢相关基因的克隆与序列分析

第一节 刺参谷氨酸脱氢酶基因克隆与序列分析

0 前言

1、材料方法

2、结果与讨论

第二节 刺参谷氨酰胺合成酶基因克隆与序列分析

0 前言

1、材料方法

2、结果与讨论

第三章 刺参在氨氮胁迫下解毒代谢途径的研究

0 前言

1、材料方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 数据处理与分析

2、实验结果

2.1 氨氮胁迫对刺参体腔液氨氮含量的影响

2.2 氨氮胁迫对刺参呼吸树解毒代谢指标的影响

2.3 氨氮胁迫对刺参体腔液解毒代谢指标的影响

2.4 氨氮胁迫对刺参体壁氨氮解毒代谢指标的影响

3、讨论

第四章 氨氮胁迫对刺参生理健康指标的影响

0 前言

1、材料方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 数据处理与分析

2、实验结果

2.1 氨氮胁迫对刺参体腔液免疫指标的影响

2.2 氨氮胁迫对刺参体腔液抗氧化能力的影响

2.3 氨氮胁迫对刺参体壁抗氧化能力的影响

3、讨论

结论

参考文献

致谢

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