诱导子诱导酪氨酸氨基转移酶基因表达对彩叶草迷迭香酸合成的影响

摘要

植物次生代谢产物具有多种重要的生物学功能，为人类提供了丰富的药物、香料和工业原料，对人类的生产和生活有着重要影响。植物次生代谢产物的种类繁多，结构迥异，从化学结构上通常归为萜类化合物、酚类化合物和含氮化合物3个主要类群。彩叶草(Coleus blumei)亦名斑叶洋紫苏、锦紫苏，归唇形科鞘蕊花属，是有着黄红紫等各种色彩的柔嫩观叶草本或亚灌木花卉，在印度、印尼、墨西哥等地被视作药用植物。研究发现彩叶草中的主要次生代谢产物为迷迭香酸。迷迭香酸(Rosmarinicacid)是一种多酚羟基酸，具有抗氧化及清除自由基作用，并具有消炎、免疫调节、抗菌、抗病毒、抗抑郁等生物活性。外源茉莉酸甲酯(MJ)作为一种重要的信号分子，能够诱导植物防御的细胞内信号转导途径从而诱导了植物次级代谢的途径。脱落酸(ABA)也是一种十分重要的信号分子，在植物面对来自生物和非生物胁迫时，可以通过应激反应改变许多基因的表达。本文从彩叶草中克隆了酪氨酸代谢途径的关键酶酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase，TAT)基因，研究彩叶草叶片经MJ和ABA诱导后TAT基因在转录表达水平及TAT酶活力变化情况，并考察了不同品种不同组织中TAT的酶活力及其对迷迭香酸含量的影响，具体结果如下： 1.利用HPLC对迷迭香酸在不同品种彩叶草(K1，K2，K3)根、茎、叶中的分布进行了检测。通过多次实验得出HPLC检测条件如下：柱子：C18柱150×4.6mm；流动相：甲醇：0.1％磷酸45：55；流速：0.9mL/min；检测波长：325nm。我们从三个彩叶草品种中筛选得到迷迭香酸含量较高的品种K2迷迭香酸含量达到1.56 mg/g。彩叶草不同品种、组织中迷迭香酸含量存在明显差异，三个品种中叶片均有较高的迷迭香酸含量，而根、茎组织中迷迭香酸含量较低。 2.建立合适的TAT活力测定方法，测定不同品种不同组织TAT活力。结果表明：彩叶草不同品种、组织TAT酶活力存在明显差异。其中K2叶片中TAT酶活力最高，达到44.29Umg-1h-1。彩叶草不同品种不同组织中TAT酶活力较高的，迷迭香酸含量也相对较高。由此猜测：TAT可能与迷迭香酸的含量呈正相关性；TAT可能在彩叶草迷迭香酸合成途径中起着非常重要的作用。 3.利用半定量RT-PCR对TAT基因在彩叶草不同品种不同组织及诱导条件下的表达情况与迷迭香酸合成量的关系进行了初步的探索。研究发现，三个彩叶草品种，TAT基因表达量从高到低依次为K2，K1，K3。K2和K1两个品种叶片中的迷迭香酸含量较高，K3次之。TAT基因在彩叶草根茎叶中为组成型表达，其中茎段TAT基因表达量最高，叶片次之，根中最少。在彩叶草三个品种均表现为叶片含有较高的迷迭香酸含量，根、茎中迷迭香酸含量较低。RA含量并不总是与TAT mRNA的表达水平相关。MJ和ABA都可以诱导彩叶草叶片TAT基因的表达，这可能是由于TAT基因可以和信号分子相互作用。 4.MJ和ABA的浓度均与彩叶草叶片的TAT活力相关。MJ浓度在0-500μmol/L的范围内，叶片的TAT活力是随着喷施的浓度升高而升高的，但是喷施浓度为600μmol/L时，TAT活力略有下降。说明MJ能够提高彩叶草叶片的TAT活性，但是这种诱导效应是在一定的浓度范围内的，浓度过高的MJ会丧失这种促进作用。不同浓度的ABA喷施彩叶草叶片后，叶片TAT活力先是升高，然后降低。其中50μmol/L ABA处理时TAT活力最高，达到82.80 Umg·-1h-1。 5.观察外源500μmol/L MJ和50μmol/L ABA对彩叶草叶片中的TAT活力的动态影响发现：用500μmol/L MJ喷施彩叶草叶片后，TAT活力随着时间的延长而逐渐增强，在72h酶活力达到最高92.85 Umg-1h-1，然后酶活力逐渐降低。经过ABA处理后，彩叶草叶片TAT酶活力也有较大幅度的提高。与MJ相比，ABA作用效果不如MJ对酶活力的影响明显，但是ABA对彩叶草中TAT活力的影响起效更快。 6.利用HPLC法测定了诱导子处理后迷迭香酸含量。结果发现：彩叶草叶片经过MJ喷施处理后，迷迭香酸含量逐渐升高，72h后，迷迭香酸含量达到3.92 mg/g。彩叶草叶片经过ABA处理48h后，迷迭香酸含量达到2.81 mg/g，是对照组的2.1倍。这个结果说明，MJ和ABA可以诱导迷迭香酸的生物合成，并且与ABA相比，MJ对迷迭香酸含量的影响更大。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略词说明

声明

1引言

1.1植物生产有用次生代谢产物的研究进展

1.1.1高等植物的次生代谢产物

1.1.2次生代谢产物分类

1.1.3次生代谢产物合成途径

1.1.4植物次生代谢研究现状

1.1.5不同因素对植物次生代谢产物合成和积累的影响

1.2彩叶草组织培养及其次生产物迷迭香酸的研究进展

1.2.1彩叶草及研究现状

1.2.2彩叶草次生代谢产物迷迭香酸的生物学特性及合成途径

1.2.3迷迭香酸合成的研究进展

1.2.4酪氨酸支路相关酶基因研究进展

1.3本研究的目的与意义

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2实验材料的处理

2.1.3菌株与质粒

2.1.4酶与各种生化试剂

2.1.5 PCR引物

2.2实验方法

2.2.1植物总RNA的提取及检测

2.2.2 cDNA第一链的合成

2.2.3目的基因的获得

2.2.4电泳目的片段的回收

2.2.5 DNA片段与克隆载体的连接

2.2.6大肠杆菌感受态细胞制备

2.2.7转化

2.2.8质粒DNA的提取

2.2.9对重组质粒的鉴定

2.2.10 TAT基因表达的半定量RT-PCR(Semiquantative RT-PCR)分析

2.3彩叶草叶片粗酶液提取及酶活力测定方法

2.3.1粗提取液制备

2.3.2 TAT酶活力测定方法

2.4.彩叶草迷迭香酸定性定量分析

2.4.1迷迭香酸标准品溶液的配制

2.4.2彩叶草迷迭香酸的提取

2.4.3高效液相色谱法定性分析提取物中迷迭香酸

2.4.4高效液相色谱法分析提取物中迷迭香酸含量

3 结果与分析

3.1不同品种彩叶草中迷迭香酸的HPLC分析及TAT酶活力测定

3.1.1彩叶草迷迭香酸的定性分析

3.1.2彩叶草不同品种不同组织中迷迭香酸的定量分析及TAT酶活力测定

3.2彩叶草RNA的提取

3.3.RT-PCR

3.4重组质粒的鉴定

3.5 TAT核苷酸序列分析

3.6 TAT蛋白进化分析

3.7彩叶草不同品种不同组织及不同诱导条件下TAT基因mRNA水平

3.7.1半定量PCR条件的确定

3.7.2不同品种彩叶草中TAT基因mRNA水平

3.7.3彩叶草不同组织器官中TAT基因mRNA水平

3.7.4诱导子诱导对彩叶草叶片中TAT基因mRNA水平表达量的影响

3.8诱导子对TAT酶活力的影响

3.9诱导子对迷迭香酸含量的影响

4讨论

4.1诱导子对植物次生代谢产物的影响

4.2诱导子对植物次生代谢途径重要基因表达水平的影响

4.3 TAT活力及TAT mRNA含量与彩叶草中迷迭香酸积累的关系

小结

参考文献

附录

附图 不同品种的彩叶草

致谢

攻读学位期间发表论文情况