弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果研究

摘要

弓形虫是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的所有哺乳动物，引起人兽共患寄生虫病。孕妇感染弓形虫可导致流产、死产、早产，存活者也常患有畸形、智力障碍等严重后遗症。在艾滋病、恶性肿瘤、器官移植等免疫力功能低下者，感染弓形虫是致死性病因之一。为了人类的健康和优生优育，研制安全有效的弓形虫疫苗，无疑是防治弓形虫病的重要措施。 随着分子生物学技术的不断发展，弓形虫疫苗从最早的全虫疫苗到新近迅速发展起来的核酸疫苗均取得了很大进展。虽然弓形虫是单细胞生物，但其生活史的复杂性，形态的多样性，入侵宿主的广泛性，造成其不同性质抗原的免疫性以及致病分子的机制均不相同，因此在研究有关弓形虫疫苗的过程中，发展多种抗原组合、针对不同生活史发育阶段的复合多价疫苗和核酸疫苗是研究弓形虫疫苗过程中的一个发展方向与共识瞳。 SAGl(p30)作为弓形虫速殖子期特异的主要表面抗原之一，含量约占虫体总蛋白的3﹪～5﹪，主要存在于弓形虫表膜及内膜系统，也可分泌到虫体外环境，具有高度的免疫原性和免疫保护性，是弓形虫感染免疫诊断和疫苗开发的主要候选抗原。 致密颗粒蛋白(dense granuleprotein，GRA)是弓形虫侵入宿主细胞后由致密颗粒释放入纳虫泡(parasitophorolJs’VgCIJble，PV)的一类分泌代谢抗原，目前已知至少有十种畸。由于该类蛋白在人体和实验中具有较强的免疫反应性和免疫原性，因而在弓形虫病诊断及免疫预防的研究中备受关注。GRA2的抗原性很强，研究表明其在急慢性弓形虫感染者血清中普遍存在。至少存在三个B细胞表位和一个T细胞表位，可诱导机体产生IgM、IgA、IgG多种抗体，激活GRA2特异的CD<,4><'+>T细胞，诱导机体的保护性免疫。因此GRA2作为弓形虫病的诊断抗原及可能的疫苗成分颇具有研究价值。国外研究资料表明：SAG1和GRA2在弓形虫特异性T辅助淋巴细胞的长期免疫机制中起重要作用，他们在弓形虫中宿主寄生史中持续表达，从慢性感染弓形虫患者的体内发现SAG1和GRA2的特异性CD<,4><'+>T细胞克隆，证明SAG1-GRA2复合基因是人类弓形虫疫苗的重要候选基因。 本研究根据已发表的弓形虫SAG1和GRA2基因序列，自行设计合成一对引物，PCR扩增得到SAG1和GRA2基因，并体外连接于pcDNA3．1质粒，构建重组质粒pcDNA3.1-SAGl和pcDNA3.1-GRA2，与复合基因真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-GRA2分别瞬时转染人成纤维细胞(HFF)，转染48小时后用Trizol提取细胞总RNA，以Oligo(dT)18为引物逆转录生成cDNA第一条链；对管家基因β-actin进行PCR验证逆转录；然后分别对SAG1、GRA2及SAG1-GRA2基因片段进行PCR，证实真核表达载体pcDNA3.1能够携带弓形虫抗原基因SAG1、GRA2及SAG1-GRA2在哺乳动物细胞中转录表达。此后，用碱裂解法大量制备质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2及pcDNA3.1-SAG1-GRA2，以肌注方式接种BalB/c小鼠(100μ g/只)，分别于2周、4周后加强免疫一次，设立PBS组、pcDNA3.1空载体组为对照，并按期采集小鼠血清，观察分析核酸疫苗所诱导的小鼠的免疫效应以及抵抗致死剂量弓形虫感染的能力。 本研究显示核酸疫苗可诱导小鼠产生对弓形虫的特异性抗体，抵抗弓形虫的感染，延长生存时间，且结果显示复合基因疫苗作用优于单基因疫苗。

目录

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摘要

符号说明

前 言

技术路线

第一部分弓形虫表面抗原SAG1及致密颗粒蛋白GRA2的单价和复合基因疫苗构建

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分弓形虫表面抗原SAG1和致密颗粒蛋白GRA2的单基因质粒及复合基因质粒在HFF细胞中的表达

一、材料

二、实验方法

结 果

讨 论

第三部分SAG1单基因、GRA2单基因及SAG1-GRA2复合基因疫苗对小鼠的免疫效果观察

一、材料

二、实验方法

结 果

讨 论

小 结

附 图

参考文献

致 谢

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