杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与HBV感染和转归的关联研究

摘要

研究背景： 乙型肝炎病毒感染是世界上最常见的病毒性疾病之一，据统计，世界上大约有3.5亿慢性乙肝病毒感染者。在中国，由乙型肝炎病毒感染引起的乙型肝炎、肝硬化乃至肝癌的患者很多，严重影响人民的身体健康。HBV的持续感染，目前认为是与病毒、宿主年龄、性别、环境以及与其他病毒如HCV、HDV、HIV的复合感染等多种因素有关。对孪生子的HBV感染研究表明宿主基因遗传因素对HBV感染的转归有重要影响。实际上，感染性疾病的易感性是由很多不同的因素调控的，如细胞因子的产生、抗原递呈和受体识别等。已有研究表明，持续HBV感染或清除的遗传易感基因呈现基因多态性，如HLA和细胞因子受体。 杀伤细胞免疫球蛋白样受体是NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原MHC-I类分子的受体，是继HLA后发现的具有高度多样性的免疫调节基因家族，对NK细胞和T细胞具有重要免疫调节作用。KIR根据功能分为抑制性和活化性两类受体。它们的膜外区有Ig样结构域，属于免疫球蛋白超家族。编码KIR的基因位于染色体19q13.42，是具有高度多样性的多基因家族。到目前为止，KIR基因家族已发现18个KIR基因，KIR基因的多样性除等位基因多态性外，还包括单倍型组成基因的多样性，不同的个体具有不同的KIR基因数目及种类，这类似于HLA-DR的基因多态性，是KIR基因多样性的特征。单倍型根据基因成分的不同分为A和B两类，因而KIR基因家族具有更丰富的多样性。KIR根据胞浆区长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序ITIM的有无，功能上分为抑制性和活化性两种。长的胞内段存在着ITIM，介导免疫细胞的抑制性信号。短的胞内段缺乏ITIM结构，但其跨膜区有带正电的赖氨酸，与其他免疫受体酪氨酸活化基序的分子偶联传导激活性信号。在人类，抑制性受体识别MHC-I类分子。理论上讲，NK细胞和T细胞活化可能是由以下两种机制之一调控的：一个是调节细胞上的活化受体产生的活化信号，另一个是抑制性受体与配体的结合传递相对较弱的抑制性信号。KIR基因与靶细胞表面的HLA-I类分子结合后，传递活化信号或抑制信号调节NK细胞和T细胞的活化，因此在抗病毒感染和肿瘤中起着重要的作用。现有的研究表明，KIR参与多种自身免疫病的发生发展，包括类风湿关节炎、血管炎、银屑病性关节炎、Ⅰ型糖尿病等均发现与KIR基因异常有关。2002年Martin等在“自然-遗传学杂志”发表KIR和HIV遗传易感性的研究报告：KIR3DS1在其相应配体HLA-Bw4-80IIe存在时能延迟HIV感染者发展为AIDS患者。Kakoo对1053例HCV感染者的K1R基因分型分析发现，KIR2DL3和HCV清除有关，可能是HCV感染的保护性基因。为探讨KIR基因与HBV感染或清除之间的关联，我们用PCR-SSP方法研究了150慢性乙型肝炎病人，251例自限性HBV感染者和412例健康正常对照的KIR基因的多态性。 目的：研究杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性与HBV感染和转归的相关性。 方法和步骤： 研究对象：我们研究分析的813例样本包括150例慢性乙型肝炎病人，251例自限性HBV感染者和412例健康正常对照。自限性HBV感染者：肝功各项指标正常，乙肝表面抗原(HBsAg)阴性，而乙肝表面抗体和乙肝核心抗体阳性。所有样本均排除甲肝、丙肝、戊肝和HIV等复合病毒感染；并除外糖尿病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病。所有患者和健康对照人群均知情同意。基因组DNA提取：采用标准盐析法提取5ml EDTA抗凝外周静脉血基因组DNA样本，-20℃保存备用。 PCR-SSP基因分型：用序列特异性引物聚合酶链式反应方法对所有收集的样本进行KIR基因分型。KIR基因位点检测15个KIP,基因和2个假基因。其中8个基因属抑制性受体，与抑制功能有关；6个基因属活化受体，传递活化信号。PCR/SSP扩增反应引物根据KIR基因序列和分型文献设计，由上海博亚生物技术有限公司合成，共32对，其中2DS5、KIR1D、3DP1(X)和3DP1v(Xv)基因用一对引物，余14个基因各用两对引物，以保证阳性基因的检出率。框架基因2DL4、3DL2和3DL3作为阳性内参照。在Gene Amp PCR System 9700PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应体系体积为20uh:含lul基因组DNA， 6ul特异引物，2ul 10×PCR buffer，1.6ul MgCl2，0.4ul dNTP，0.125ul Taq DNA聚合酶和8.875ul双蒸水。反应条件：96℃1 min；96℃ 25see，65℃ 45sec和72℃ 30sec，5循环；96℃ 25see，60℃ 45see和72℃30see，21循环；96℃ 25sec，55℃ 60sec和72℃ 120sec，5循环；72℃延伸10min。 琼脂糖凝胶电泳和成像：PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，160V电压电泳30分钟。电泳完毕，用ALPHA2200凝胶图象分析仪进行电泳图象分析，对每个样本进行KIR基因分型分析。 单倍型分析：根据以下KIR基因单倍型分型综合标准： (1)所有单倍型均包含3DL3、2DIA和3DL2； (2)一个单倍型中含有2DL2或2DL3，但非同时存在； (3)一个单倍型中含有3DP1或3DP1v，但非同时存在； (4)单倍型B携带一个或多个KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5和KIR3DS1，而单倍型A不包含这些基因。 统计学分析：观测到的KIR基因出现频率(F)通过直接计数测得，pf(％)=阳性基因数厮究组总人数；KIR基因频率的计算公式为gf=1-(1-pf)，；单倍型频率(％)=观测单倍型阳性数/2n，n为研究个体数。用SAS9.0软件包四格表双尾Fisher精确检验或x2检验对KIR基因频率间的差异进行显著性分析。 结果： 1.在CHB病人组和对照组中均可检测到所有18种KIR基因：所有个体均检测到3个框架基因以及KIRZ。 2.CHB病例组KIR2DL5、KIR2DS2、KIR2DS3和KIR2DS5基因的阳性率较健康对照组升高，且具有显著性差异。 3.CHB病例组KIR2DS2和KIR2DS3基因的阳性率较自限性HBV感染组升高，而KIR2DL5、KIR2DS1和KIR3DS1基因的阳性率较自限性HBV感染组减低且具有显著性差异。2DS5基因频率在两组之间没有显著性差异。 4.自限性HBV感染组KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS5和KIR3DS1基因的阳性率较健康对照组明显升高，而KIR2DS2和KIR2DS3基因频率在两组之间没有显著性差异。 5. 具有两个以下活化性KIR基因的个体在健康对照组比CHB病例组和自限性HBV感染组明显增多，而具有两个或以上活化性KIR基因的个体在CHB病例组和自限性HBV感染组比正常对照组明显增多，差异具有显著性。 6.在三组人群中共发现32种基因型。CHB病例组基因型G、M和FZ1的频率较健康对照组增高。自限性HBV感染组基因型AH的频率较CHB病人组和健康对照组均增高。自限性HBV感染组基因型G和AH的频率比健康对照组增高，而AF和AJ比健康对照组降低。 7.CHB病人组单倍型2频率比正常对照组减低而单倍型4和单倍型8比正常对照增高。与CHB病人组相比，自限性HBV感染组单倍型5的频率增高而单倍型8频率降低。自限性HBV感染组单倍型1和单倍型2比正常对照组减低而单倍型4和5比正常对照组增高。 8. CHB病人组和自限性HBV感染组A单倍型频率均比健康对照组减低，而B单倍型频率均比对照组增高℃HB病人组和自限性HBV感染组间A单倍型和B单倍型频率均无显著性差异。 结论：我们用病例对照研究的方法，利用SSP-PCR技术，分别对健康对照组、自限性乙肝病毒感染患者和慢性乙肝患者的KIR基因进行了检测，分析了三组研究对象的基因型和单倍型，结果表明KIR基因多态性很可能与HBV的遗传易感性和HBV感染后的转归有关。 1、KIR2DS2和KIR2DS3是HBV易感基因：慢性乙肝患者组的KIR2DS2和KIR2DS3的基因频率明显高于健康对照组和自限性乙肝病毒感染患者组，后两组中KIR2DS2和KIR2DS3之间没有统计学差异，提示KIR2DS2和KIR2DS3基因的存在与乙型肝炎病毒的持续性感染有关，持续的肝脏组织损害和乙型肝炎病毒的存在而导致慢性乙型肝炎。 2、KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5可能是保护基因，促进HBV的清除：自限性乙肝病毒感染组KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5基因频率明显高于健康对照组和慢性乙型肝炎患者组，提示KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5KIR基因的存在有利于乙肝病毒的清除。 3、KIR基因型和单倍型可能与.HBV的遗传易感性或清除有关：自限性乙肝病毒感染组基因型AH的频率较慢性乙型肝炎病人组和健康对照组均增高，提示AH基因型有利于乙型肝炎病毒的清除；慢性乙型肝炎病人组和自限性乙肝病毒感染组与健康对照组相比A单倍型频率均减低，而B单倍型频率均增高，CHB病人组和自限性HBV感染组间A单倍型和B单倍型频率均无显著性差异，提示KIR基因B单倍型者易感染乙型肝炎病毒。

目录

论文说明：符号说明

声明

前 言

资料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综述 杀伤细胞免疫球蛋白样受体的研究进展

附 图

致 谢

攻读博士学位期间发表论文题录

外文论文1

外文论文2