低剪切力介导内皮细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的机制及辛伐他汀干预的研究

摘要

背景: 动脉粥样硬化致病机理一直是心血管领域的研究热点，先后有血栓形成学说、炎症学说、脂质浸润学说、单克隆学说、损伤反应学说、氧化学说、同型半胱氨酸学说以及精氨酸学说。Pober和Cotran在大量血流动力学与动脉粥样硬化关系的研究成果基础上，提出了动脉粥样硬化发病学的剪切力学说（shear stress hypothesis），认为血流剪切力异常是促使动脉粥样硬化病变形成的重要原因之一。 根据血管内皮细胞精细调节多种“血管保护”效应分子的反应能力和流体机械力调节内皮细胞基因表达的潜能，剪切力学说认为，均匀的层流剪切力可选择性地诱导内皮“动脉粥样硬化保护性基因”的表达，从而作用于局部以抵消全身性危险因素的有害作用。血流动力学因素异常出现层流剪切力不均匀，内皮细胞分泌抗动脉粥样硬化分子减少，高胆固醇血症、高半胱氨酸血症等危险因素的持续作用可促使动脉粥样硬化病变的发生。显然，动脉粥样硬化灶性分布特点主要由血流动力学因素介导的血管易损性程度所决定。该定位分布特点在人体和实验动物均已得到证实，这有力地说明剪切力与动脉粥样硬化病变发生部位的紧密关系。研究表明人的动脉管壁处于生理剪切力区域（剪切力≥l2dyne/c㎡）有抑制动脉粥样硬化形成的保护性作用，而低剪切力区域（剪切力≤4dyne/c㎡）有促动脉粥样硬化形成作用。 膜型基质金属蛋白酶1（membrane type-1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP，MMP-14）是唯一锚定于细胞膜上的胶原蛋白酶，其底物广泛包括：胶原，纤连蛋白，层连蛋白，弹性蛋白，纤溶酶原等。实验表明MT1-MMP可以通过促进单核细胞迁移、降解细胞外基质包括胶原等，促进易损斑块的发生和发展。新近实验通过选择性基因敲除和过表达两个方面证实，MT1-MMP通过影响斑块胶原纤维含量在易损斑块的形成过程中起到重要作用。 已有实验证实，低剪切力可以上调MMP-2和MMP-9的表达，同时增加其活性，MT1-MMP可以通过活化MMP-2和MMP-9前胶原形式增加其活性。然而，低剪切力与MT1-MMP的关系尚未明了。因此我们提出了这样的假设：低剪切力可诱导MT1-MMP的表达，从而参与动脉粥样硬化斑块的形成。 研究目的： 1.在低剪切力动物模型中，观察低剪切力对MT1-MMP的作用。 2.在体外细胞研究中，明确低剪切力与MT1-MMP的关系。 研究方法: 1.动物模型 20只8～10周龄雄性ApoE-/-小鼠，均给予高脂饮食（含0.25％胆固醇和15％脂肪）喂养。通过缩窄性颈总动脉套管建立ApoE-/-小鼠左侧颈总动脉低剪切力动脉粥样硬化斑块模型，右侧颈总动脉假手术对照。 2.显微超声测量 应用显微超声技术测量小鼠左侧和右侧颈总动脉最大内膜中层厚度（IMT），收缩期内径（Ds），近心端最大血流速度（Vmax）。根据公式τ（N/㎡）=4·Vmax·η/Ds，η是血液粘滞系数（采用η=0.035）计算小鼠左右两侧颈总动脉剪切力（τ）。 3.病理学检测 8周末应用过量戊巴比妥钠注射使小鼠安乐死后，PBS液体灌洗血管，继之灌注4％的多聚甲醛固定液。分离左侧颈总动脉和右侧颈总动脉，取材后标本置于4％的多聚甲醛固定液中浸泡固定12小时，OCT包埋，制作5um冰冻切片，标本每间隔50 um即连续切片20张，苏木素-伊红染色。其它相邻切片做免疫组化检测MT1-MMP的分布和含量。 4.体外人脐静脉内皮细胞培养及鉴定 4.1人脐静脉内皮细胞的原代培养与传代 无菌获取剖宫产新生儿脐带15-20cm，冲洗脐静脉管腔。将脐带另一端用止血钳夹闭，注入胰酶于超净台上室温消化5-7 min。将胰酶抽出，置于离心管内，再冲洗管腔，洗出液置于离心管内，加入胎牛血清终止消化。离心10min，于超净台上将离心管内的上清液倒掉，以全培养基将细胞重新悬浮，转移至培养瓶内，置于孵箱中培养，12-24h后换液，清除未贴壁细胞。 4.2传代 待原代细胞融合成单层后，用PBS将细胞洗两遍，以去除血清，加入0.25％胰酶2 ml，孵箱内消化3-5min，在倒置相差显微镜下观察见细胞变成圆形，吸出胰酶，加入培养基，轻轻吹打，待细胞全部悬浮，按105个/ml分装，放回37℃孵箱中继续培养。 4.3内皮细胞鉴定 免疫荧光法检测CD31、CD34和Ⅷ因子：HUVECs接种于预先置于细胞培养板内的盖玻片上，至细胞长成单层，弃培养液，PBS洗3次，加入95％乙醇固定30min，PBS冲洗，采用免疫荧光染色，滴加相应抗体血清，再滴加1：40荧光素标记的羊抗兔疫荧光抗体，设阴性及空白对照。荧光显微镜下观察、拍片。 5.内皮细胞剪切力干预分组 5.1不同作用时间下，低剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响 1）静态对照组：不给予剪切力，细胞在静态下培养。 2）低剪切力1小时组：给予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用1小时，以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。 3）低剪切力3小时组：给予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用3小时，以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。 4）低剪切力5小时组：给予低剪切力（4 dyne/c㎡）作用5小时，以观察MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的变化。 5.2相同作用时间下，不同剪切力对脐静脉内皮细胞表达MT1-MMP mRNA及其蛋白质活性的影响 1）静态对照组：细胞不给予任何剪切力。 2）低剪切力组：给予低剪切力（4 dyne/c㎡2）分别作用1、3、5小时，观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。 3）生理剪切力组：给予生理性剪切力（12 dyne/c㎡）分别作用1、3、5小时，观察低剪切力对MT1-MMP mRNA及蛋白质活性的影响。 6.实时定量RT-PCR 根据试剂盒说明，以Trizol自HUVECs中提取总RNA。用M-MLV试剂盒进行逆转录。于Light Cycler上实行实时定量PCR。每个样本重复三次测量。MT1-MMP扩增引物：上游5'-ACGTGCAGCAGCATTGGA-3'，下游5'-CAACAGGAGCAAGTGTGCCTTC-3'；β-actin扩增引物，上游5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游5'-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。反应结束得到循环阈值（Ct值），用相对定量的方法（2-△△Ct）来分析数据。MT1-MMP mRNA表达以管家基因β-actin进行标化。 7.Western Blot分析 收集细胞后，提取总蛋白，煮沸5分钟。以SDS-PAGE电泳，然后转膜，封闭，洗膜三次。以适当浓度的一抗4℃过夜后，洗膜。二抗孵育、洗膜，最后采用增强化学发光法观察结果。 8.MT1-MMP活性测定 收集细胞后，加入适量蛋白提取液，收集上清液待查。吸取待测蛋白以及蛋白标准品加入96孔板中，轻轻摇晃20s，4℃孵育过夜。洗板4次，每孔滴加结合液50ul，混匀，滴加50ul反应试剂，摇晃20s混匀，在405nm读取t0值。37℃孵育2.5h，摇晃20s，405nm读取t值。由标准品浓度根据浓度和（t-t0）×1000/6.25呈线性关系描绘标准曲线，由标准曲线得出待测值。 9.统计分析 实验结果以均数±标准误表示。应用SPSS13.0软件进行分析，两两比较采用t检验，多组之间采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。 结论： 1.在ApoE-/-小鼠低剪切力模型中，低剪切力可以上调MT1-MMP的表达。 2.在体外研究中，低剪切力上调MT1-MMP的表达，提示低剪切力诱导的MT1-MMP表达上调在动脉粥样硬化斑块发生和/或发展过程中具有重要的作用。

目录

声明

论文Ⅰ 低剪切力与膜型基质金属蛋白酶1的关系研究

中文摘要Ⅰ

AbstractⅠ

符号说明

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

附图

参考文献

论文Ⅱ 低剪切力介导内皮细胞表达膜型基质金属蛋白酶l的机制研究

中文摘要Ⅱ

AbstractⅡ

符号说明

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

附图

参考文献

论文Ⅲ 辛伐他汀抑制低剪切力介导内皮细胞表达膜型基质金属蛋白酶1的机制研究

中文摘要Ⅲ

AbstractⅢ

符号说明

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.结论

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间完成的论文

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英文论著Ⅱ