哈氏噬纤维菌CHU_0344蛋白和CHU_0099蛋白的生物学功能研究

摘要

能源、资源以及环境问题是21世纪人类生存发展所面临的最严峻挑战，也是制约我国社会经济发展的主要因素。从长远看，石油资源将在本世纪上半叶迅速走向枯竭的边缘，开发可持续利用的替代资源的任务已非常紧迫。生物质能(biomass energy)，就是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式，即以生物质为载体的能量，它直接或间接地来源于绿色植物的光合作用，可转化为常规的固态、液态和气态燃料，取之不尽、用之不竭，是一种可再生能源，同时也是唯一一种可再生的碳源。纤维素类物质是生物质资源的主体部分（占其总量的80％以上），价格低廉，供应充足，且尚未得到充分开发利用。
　　 哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii ATCC33406）是自然界中广泛存在的一类可降解结晶纤维素的好氧细菌，它降解结晶纤维素速度较快并且彻底。哈氏噬纤维菌降解结晶纤维素的策略不同于已知的好氧真菌或厌氧细菌，其菌体不分泌明显的胞外纤维素酶，菌体表面也未检测到纤维小体结构，参与结晶纤维素降解的相关酶和蛋白尚缺乏研究。因此，哈氏噬纤维菌作为一种独特的结晶纤维素降解细菌，对其纤维素降解机制的阐明，将对开发新的纤维素降解策略以更好利用纤维素资源有重要意义。本论文以C.hutchinsonii为研究对象，围绕其胞外分泌的主要蛋白和可能存在体眠状态的生理特征，初步探究了CHU_0344蛋白和CHU_0099蛋白的生物学功能，为进一步揭示C.hutchinsonii独特的胞外蛋白分泌机制与休眠状态的复苏因子提供重要依据。
　　 CHU_0344蛋白是C.hutchinsonii胞外的主要分泌蛋白，而且具有结合微晶纤维素的能力。生物信息学分析显示CHU_0344没有信号肽，但具有类似CTD的碳端结构域，可能是通过一种新型的蛋白运输系统porSS运输到胞外的蛋白。本论文通过分子克隆转化技术在E.coli中成功表达了可溶性的CHU_0344融合蛋白，并同时从菌体培养物中分离纯化了天然CHU_0344蛋白，通过比较融合蛋白和天然蛋白的性质和结构特点发现，天然蛋白和融合蛋白均具有结合微晶纤维素的能力，但是两种蛋白的结构有所不同。CHU_0344天然蛋白是一种核酸结合蛋白，蛋白质中的巯基以自由巯基的状态存在，没有明显的二硫键结构，Westernblot结果显示该蛋白主要定位在细胞表面或分泌到胞外。而异源表达的融合蛋白则没有结合核酸，并形成二硫键结构。结果表明该蛋白在C.hutchinsonii和E.coli中的成熟过程明显不同，为进一步深入研究C.hutchinsonii新型的胞外蛋白分泌机制提供依据。通过基因敲除技术获得CHU_0344基因敲除突变株，发现突变株在固体介质上的运动能力明显下降，说明CHU_0344可能与C.hutchinsonii的运动相关。
　　 C.hutchinsonii在培养后期细胞形态发生明显变化，活性也显著下降，推测可能存在休眠状态。生物信息学分析显示，CHU_0099同沙门氏菌的复苏促进因子(resuscitation promoting factor，Rpf)的序列有一定相似性，同源模建显示CHU0099蛋白质的三级结构也与沙门氏菌的Rpf蛋白具有高度的相似性，因此推测CHU_0099蛋白可能是一种复苏促进因子。通过基因敲除技术获得CHU_0099基因敲除突变株，发现突变株在固体介质上的运动能力明显下降，在液体培养条件下的生长能力和在固体平板上的菌落形成能力均有所下降。通过分子克隆转化技术在E.coli中成功表达了可溶性的CHU_0099融合蛋白，证明CHU_0099融合蛋白能够促进C.hutchinsonii野生株的衰老细胞的复苏生长，说明该蛋白可能是C.hutchinsonii的复苏促进因子，这是在拟杆菌门中首次发现的类Rpf蛋白。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 前言

1．1 研究纤维素降解的意义

1．2 纤维素的结构特征

1．3 降解纤维素的微生物

1．3．1 降解纤维素的真菌(Cellulolytic Fungi)

1．3．2 降解纤维素的细菌(Cellulolytic Bacteria)

1．3．3 降解纤维素的放线菌(Cellulolytic Actinomycete)

1．4 纤维素的生物降解机制

1．4．1 游离的纤维素酶系协同降解机制

1．4．2 厌氧细菌的降解机制——纤维小体

1．4．3 第三种纤维素降解机制

1．5 Cytophaga hutchinsonii研究背景

1．6 细胞复苏促进因子

1．7 本论文主要工作

第二章 CHU_0344融合蛋白的表达和天然蛋白纯化

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 主要试剂和工具酶

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基

2．1．5 C．hutchinsonii的培养

2．1．6 C．hutchinsonii的胞外分泌蛋白的提取

2．1．7 C．hutchinsonii的周质空间蛋白的提取

2．1．8 CHU_0344蛋白的质谱鉴定

2．1．9 CHU_0344蛋白的序列分析

2．1．10 CHU_0344融合蛋白的表达及纯化

2．1．11 CHU_0344天然蛋白的纯化

2．2 实验结果

2．2．1 C．hutchinsonii的胞外分泌蛋白的提取

2．2．2 C．hutchinsonii的周质空间蛋白的提取

2．2．3 CHU_0344蛋白的序列分析

2．2．4 CHU_0344融合蛋白表达载体的构建

2．2．5 CHU_0344融合蛋白的纯化

2．2．6 CHU_0344天然蛋白的纯化

2．3 本章小结

第三章 CHU_0344蛋白的生物学功能研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株及质粒

3．1．2 主要试剂和工具酶

3．1．3 主要仪器

3．1．4 培养基

3．1．5 CHU_0344蛋白多克隆抗体的制备

3．1．7 Western blot

3．1．8 CHU_0344蛋白在哈氏噬纤维菌上的定位实验

3．1．9 CHU_0344蛋白对纤维素粉结合能力的测定

3．1．10 CHU_0344蛋白的非还原SDS-PAGE检测和Native-PAGE检测

3．1．11 利用HPLC对CHU_0344天然蛋白分子量的检测

3．1．12 CHU_0344天然蛋白可能集合核酸的猜测

3．1．13 CHU_0344蛋白自由巯基的测定

3．1．14 CHU_0344蛋白的醌蛋白脱氢酶的酶活测定

3．1．15 CHU_0344 mutant生长曲线及平板单菌落个数统计

3．1．16 CHU_0344 mutant在贫瘠培养基上运动能力的变化检测

3．2 实验结果

3．2．1 CHU_0344蛋白多克隆抗体的制备检测

3．2．2 CHU_0344蛋白在哈氏噬纤维菌上的定位实验

3．2．3 CHU_0344蛋白对纤维素粉结合能力的测定

3．2．4 CHU_0344蛋白的非还原SDS-PAGE检测和Native-PAGE检测

3．2．5 利用HPLC对CHU_0344天然蛋白分子量的检测

3．2．6 CHU_0344天然蛋白可能结合核酸的猜测

3．2．7 CHU_0344蛋白自由巯基的测定

3．2．8 CHU_0344蛋白的醌蛋白脱氢酶的酶活测定

3．2．9 CHU_0344 mutant生长曲线及平板单菌落个数统计

3．2．10 CHU_0344 mutant在贫瘠培养基上运动能力的变化检测

3．3 本章小结

第四章 CHU_0099蛋白的表达纯化和生物学功能研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株及质粒

4．1．2 主要试剂和工具酶

4．1．3 主要仪器

4．1．4 培养基

4．1．5 CHU_0099蛋白的序列分析

4．1．6 CHU_0099融合蛋白的表达及纯化

4．1．7 CHU_0099敲除菌株的构建

4．1．8 C．hutchinsonii中CHU_0099基因过表达菌株的构建

4．1．9 CHU_0099 mutant生长曲线的测定

4．1．10 CHU_0099 mutant和过表达菌株不同稀释浓度下单菌落个数统计

4．1．11 CHU_0099 mutant在PY2平板上单菌落扩散能力的变化检测

4．1．12 CHU_0099蛋白对C．hutchinsonii衰老细胞复苏能力的检测

4．1．13 CHU_0099蛋白对CHU_0099 mutant衰老细胞复苏能力的检测

4．2 实验结果

4．2．1 CHU_0099蛋白序列的生物信息学分析

4．2．2 CHU_0099融合蛋白的表达及纯化

4．2．3 CHU_0099敲除菌株的构建

4．2．4 C．hutchinsonii中CHU_0099基因过表达菌株的构建

4．2．5 CHU_0099 mutant生长曲线的测定

4．2．6 CHU_0099 mutant和过表达菌株不同稀释浓度下单菌落个数统计

4．2．7 CHU_0099 mutant在PY2平板上单菌落扩散能力的检测

4．2．8 CHU_0099蛋白对C．hutchinsonii野生型和CHU_0099 mutant衰老细胞复苏能力的检测

4．3 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表