FAM83D促进非小细胞肺癌细胞上皮间质转化及侵袭迁移的作用研究

摘要

研究背景:
　　肺癌是最常见的癌症之一，发病率与死亡率位居恶性肿瘤之首。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌诊断病例的80％-85％。随着放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗的广泛应用，NSCLC患者预后得到明显改善。然而，因NSCLC早期常无明显症状，40％左右的肺癌患者被确诊时已处于中晚期或已出现转移，包括淋巴结、脑和肝组织的远处转移等。对于已经出现转移的NSCLC患者目前尚缺乏有效的治疗手段，其5年生存率不足15％，复发和转移仍是NSCLC患者死亡的最主要原因。目前，NSCLC发生转移的分子机制尚未完全阐明，深入研究NSCLC转移相关的发病机制，对寻找有效的治疗靶点、提高NSCLC晚期患者的生存率和生活质量具有重要意义。
　　细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，在癌症的转移和多纤维化疾病中发挥了重要作用。在上皮间质转化过程中，癌症细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转化，细胞间黏附能力减弱，细胞侵入性和迁移能力增强，进而促进肿瘤细胞发生远处转移。虽然EMT在一些研究中被证实是癌症转移的关键条件，但是在NSCLC转移中的作用机制尚不完全清楚。
　　FAM83D(family with sequence similarity83，member D，又称CHICA)是近年来发现的位于人20号染色体长臂(20q)的有丝分裂相关基因，其表达产物FAM83D首先作为一种纺锤体蛋白被大家认识。目前研究表明，FAM83D在不同类型的人类癌症中存在扩增和过表达，包括肝癌、卵巢癌和肺腺癌等。据报道，FAM83D在乳腺癌中通过调控FBXW7/mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶体蛋白）信号通路促进细胞增殖、侵袭及EMT;在直肠癌中通过调控FBXW7/Notchl信号通路促进直肠癌的发生和转移;在肺腺癌中通过调控细胞周期而发挥其致癌活性;在肝细胞癌中通过MEK/ERK促进细胞增殖和迁移能力等。上述研究结果表明，FAM83D与肿瘤发生发展关系密切，然而，FAM83D是否调控NSCLC的EMT以及侵袭转移尚未有研究报道。
　　本研究旨在探索FAM83D调控NSCLC细胞EMT及侵袭转移的作用，并深入研究其可能的分子机制。本研究不仅补充了FAM83D在NSCLC细胞中的生物学功能，还进一步完善了其作用机制，并为晚期NSCLC的治疗提供了新的研究思路和理论基础。
　　研究目的:
　　探究FAM83D对NSCLC细胞增殖、EMT、侵袭转移的作用及机制。
　　研究方法:
　　1.在NSCLC细胞及正常肺上皮细胞、NSCLC组织及癌旁组织中检测FAM83D的表达
　　(1)应用本实验室保存的7种肺癌细胞株和2种正常肺上皮细胞株，通过qRT-PCR、Western blot检测FAM83D的表达情况。
　　(2)收集40例NSCLC及癌旁组织，免疫组织化学方法检测FAM83D在上述组织中的表达情况并分析FAM83D在癌旁肺组织、NSCLC组织及转移型NSCLC组织中的表达差异。
　　2.探究FAM83D对NSCLC细胞EMT的发生、细胞增殖、侵袭及迁移的影响
　　(1)采用慢病毒感染和逆转录病毒感染方法分别构建FAM83D沉默细胞系(A549-shFAM83D-1、A549-shFAM83D-2和H1299-shFAM83D-1、H1299-shFAM83D-2)、过表达细胞系(BEAS2B-FAM83D)及相应的对照细胞系，嘌呤霉素筛选后，应用qRT-PCR和Western blot检测FAM83D的表达。
　　(2)应用上述构建的细胞系，通过MTT及克隆形成实验检测FAM83D对NSCLC细胞增殖的影响;通过划痕实验、Transwell及Matrigel实验检测FAM83D对NSCLC细胞迁移、侵袭能力的影响;通过Western blot及免疫荧光实验检测FAM83D对NSCLC细胞EMT的影响。
　　3.探究FAM83D促进NSCLC细胞侵袭转移及EMT的作用机理
　　(1)应用Western blot检测FAM83D沉默或过表达细胞系中蛋白激酶B(AKT)/p-AKT、mTOR/p-mTOR及核糖体蛋白S6激酶p70S6k/p-p70S6k的表达变化，确定FAM83D能够激活AKT/mTOR信号通路。
　　(2)分别应用AKT信号通路抑制剂MK2206和mTOR信号通路抑制剂Rapamycin处理FAM83D过表达细胞系及其对照细胞系，通过Transwell小室实验及Western blot分别检测细胞迁移能力和EMT标记蛋白表达的改变，确定FAM83D通过AKT/mTOR信号通路调控NSCLC细胞的EMT及迁移侵袭。
　　研究结果:
　　1.FAM83D在肺癌细胞及肺癌组织中的表达水平明显高于正常肺上皮细胞和癌旁组织
　　(1)应用qRT-PCR和Western blot检测肺癌细胞和正常肺上皮细胞中FAM83D蛋白的表达情况，结果显示肺癌细胞中FAM83D mRNA和蛋白水平明显高于正常肺上皮细胞，而在高侵袭性肺癌细胞中升高更为显著。
　　(2)采用免疫组织化学法检测NSCLC及癌旁组织中FAM83D蛋白的表达情况，结果显示FAM83D在癌旁组织中表达最低，在NSCLC组织中表达相对较高，而在已发生转移的NSCLC组织中表达最为显著。
　　2.FAM83D促进NSCLC细胞的肿瘤特性
　　(1)FAM83D促进NSCLC细胞的增殖
　　MTT及克隆形成实验结果显示:与对照组细胞相比，过表达FAM83D促进BEAS2B细胞增殖，沉默FAM83D表达抑制NSCLC细胞A549增殖。
　　(2)FAM83D促进NSCLC细胞EMT发生
　　Western blot及免疫荧光结果显示:FAM83D过表达显著增加BEAS2B细胞间质细胞标记蛋白N-cadherin和Vimentin表达，抑制上皮细胞标记蛋白E-cadherin和α-catenin表达;相反，FAM83D沉默表达明显抑制A549和H1299细胞间质细胞标记蛋白N-cadherin和Vimentin表达，增加上皮细胞标记蛋白E-cadherin和α-catenin表达。
　　(3)FAM83D促进NSCLC细胞侵袭和迁移
　　划痕实验和Transwell小室结果显示:FAM83D过度表达促进细胞划痕愈合、促使更多的细胞穿过BD小室底膜，而FAM83D沉默表达抑制细胞划痕愈合、抑制细胞穿过BD小室底膜。Matrigel实验结果显示:FAM83D过度表达后，穿过基质胶和BD小室底膜的细胞数增多，FAM83D沉默表达后，穿过基质胶和BD小室底膜的细胞数明显减少。
　　3.FAM83D调控AKT/mTOR信号通路促进NSCLC转移
　　(1)FAM83D激活AKT/mTOR信号通路
　　Western blot结果显示:FAM83D沉默或过表达后，AKT和下游靶蛋白mTOR、p70S6k的总表达水平没有变化，但是FAM83D过表达后，p-AKT、p-mTOR和p-p70S6k水平明显升高;相反，FAM83D沉默表达后，p-AKT、p-mTOR和p-p70S6k水平明显降低。
　　(2)FAM83D通过调节AKT/mTOR通路促进NSCLC细胞EMT及侵袭迁移
　　为了进一步验证FAM83D通过调节AKT/mTOR通路调控NSCLC细胞的肿瘤特性，我们通过Transwell、Western blot实验检测经抑制剂处理后的细胞迁移能力以及EMT标记分子表达的改变，结果表明，加入MK2206或Rapamycin后，FAM83D促进BEAS2B细胞迁移的能力被抑制;由FAM83D诱导的BEAS2B细胞EMT标记分子的表达变化受到抑制，即Vimentin和N-cadherin表达增加、E-cadherin表达降低的趋势受到显著抑制。
　　研究结论及意义:
　　1.FAM83D能够促进NSCLC细胞EMT的发生，增强NSCLC细胞侵袭和迁移能力。
　　2.FAM83D通过激活AKT/mTOR信号通路促进NSCLC细胞侵袭迁移及EMT的肿瘤特性。
　　本研究不仅补充了FAM83D在NSCLC细胞中的生物学功能，也初步探索了其促进NSCLC转移的机制，为晚期NSCLC的治疗提供了新的研究思路。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．实验材料

1．1 细胞株及质粒

1．2 细胞培养及冻存试剂

1．3 质粒构建及提取试剂

1．4 RNA提取及qRT-PCR试剂

1．5 蛋白质提取试剂

1．6 细胞转染试剂

1．7 抗体

1．8 Western blot实验试剂

1．9 免疫荧光和免疫组化实验试剂

1．10 其他试剂

2．主要实验仪器

3．实验方法

3．1．主要溶液和试剂的配制

3．2．细胞转染

3．3．细胞RNA提取

3．5．琼脂糖凝胶电泳

3．6．免疫组织化学染色

3．7．总蛋白提取

3．8．BCA法测试蛋白浓度

3．9．Western blot

3．10．逆转录病毒制备和感染

3．11．慢病毒制备和感染

3．12．注意事项

3．13．质粒构建及纯化

3．14．细胞迁移实验

3．1 5．细胞划痕实验

3．16．细胞侵袭实验

3．17．MTT实验

3．18．免疫荧光实验

3．19．统计学分析

结果

1．FAM83D在NSCLC细胞和组织中表达明显升高

1．1 FAM83D在NSCLC细胞中高表达

1．2 FAM83D在NSCLC组织中高表达

2．FAM83D促进NSCLC细胞的肿瘤特性

2．1．构建FAM83D稳定沉默和过表达细胞系

2．2．FAM83D促进NSCLC细胞增殖

2．3．FAM83D促进NSCLC细胞EMT的发生

2．4．FAM83D促进NSCLC细胞侵袭和迁移

3．FAM83D调控AKT／mTOR信号通路促进NSCLC转移

3．1．FAM83D激活AKT／mTOR信号通路

3．2．FAM83D通过调控AKT／mTOR通路促进NSCLC细胞转移

讨论

展望

附图

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文