锌离子对大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤作用及可能机制研究

摘要

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，以肌僵直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。PD病理特征主要是中脑黑质致密带(substantia nigra pars compact，SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元死亡。PD的病因未完全明了，可能有多种因素参与，如遗传、环境因素、氧化应激、兴奋性毒素、自身免疫、黑质(substantia nigra，SN)铁聚积和细胞凋亡等。近来，越来越多的研究开始关注二价金属离子锌在神经退行性疾病中的作用。锌离子是人体必需的微量元素，脑组织中不少酶类和神经递质的合成均需其参与，并且具有广泛的生物学效应。锌含量不足或过高时，均能引起机体相应的生化过程紊乱，从而导致疾病。神经化学、临床以及流行病学等方面的研究提示锌等二价金属离子可能参与PD的发病；在有长年锌接触史的人群中PD发病率升高；PD病人SN中锌含量与正常人相比增加50.54％。但目前，关于锌离子引起SN DA能神经元损伤的具体作用机制尚未明确，需进行深入研究。 为探讨锌离子导致大鼠SN DA能神经元的损伤作用及其可能机制，本实验选择Wistar大鼠腹腔注射七水硫酸锌14天后，应用ICP-2(Inductively Coupled Plasma Detector)检测仪观察SN内锌离子含量的改变；利用高效液相色谱电化学检测法(high performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)和免疫组织化学的方法观察锌离子对纹状体(striatum，Str)DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量以及SNpc DA能神经元存活情况的影响；应用快速周期伏安法(fast cyclicvoltammetry，FCV)在体检测锌离子对大鼠Str内DA释放量的影响；利用生物化学的方法观察了大鼠中脑氧化应激状态的改变以及SN内caspase-3活性的改变；应用western blots技术检测了SN胞浆和线粒体内细胞色素c(cytochrome c)的分布情况；利用免疫荧光双标技术观察了SN内DA能神经元的凋亡。 结果如下： 1.高剂量组(50mg/kg)大鼠SN内锌离子含量与对照组，12.5mg/kg组，以及25mg/kg组相比均增加(P<0.01)，但两个低剂量组(12.5，25mg/kg)与对照组相比无统计学差别。 2.高剂量组锌离子注射后引起大鼠Str DA和HVA含量与对照组和两个低剂量组相比均减少(P<0.01)，DOPAC的含量虽然有所降低，但与其他组相比无统计学差别。两个低剂量组Str内DA、DOPAC和HVA含量与对照组相比无统计学差别。 3.各个剂量组(25，50mg/kg)锌离子注射后均未观察到大鼠Str内DA释放量的减少，且与对照组相比无统计学差别。 4.高剂量组锌离子导致大鼠SN内Nissl染色阳性细胞数与对照组和两个低剂量组相比均减少(P<0.01)，但两个低剂量组与对照组相比SN内神经元的数目没有影响，无统计学差别。 5.高剂量组锌离子大鼠SN内TH免疫阳性细胞数与对照组和两个低剂量组相比均减少(p＜0.01)，但两个低剂量组与对照组比较对SN内TH免疫阳性细胞数目没有影响，无统计学差别。 6.高剂量组锌离子大鼠中脑内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量与对照组和两个低剂量组相比均升高(P<0.01)，12.5，25mg/kg组对于中脑内MDA的含量没有影响，和对照组比较无统计学差别。 7.高剂量组锌离子大鼠中脑内超氧化物岐化酶(SOD)的活性与对照组和两个低剂量组相比均下降(P<0.05)，造成中脑抗氧化系统的损伤。但两个低剂量组对SOD的活性没有影响，与对照组相比无统计学差别。 8.Hoechst33258染色和TH免疫荧光双标结果表明：高剂量组锌离子注射可引起大鼠SN内TH阳性神经元凋亡的发生。 9.高剂量组大鼠SN内caspase-3的活性与对照组和两个低剂量组相比均升高(P<0.01)，但两个低剂量组对caspase-3的活性没有影响，与对照组相比无统计学差别。 10.高剂量组大鼠SN线粒体内细胞色素c的蛋白表达量与其他组相比下降(P<0.05)，但胞浆内细胞色素c的蛋白表达量显著增加(P<0.01)，表明细胞色素c从线粒体释放到胞浆。对照组和两个低剂量组SN胞浆内没有观察到细胞色素c的蛋白表达，线粒体内其蛋白表达量也未见减少。 上述结果说明，腹腔注射七水硫酸锌可引起SN内锌离子含量增加，增加的锌离子可引起Str内DA及其代谢产物含量减少，但对DA的释放量没有影响，锌离子可导致SN内神经元和TH免疫阳性细胞数目减少，表明外周给与锌离子可以造成SN-Str系统DA能神经元的损伤。该损伤作用可能是通过增加中脑内MDA的含量，降低SOD的活性，导致高氧化应激状态，引起线粒体损伤，使细胞色素c从线粒体释放到胞浆，激活caspase-3，从而导致细胞凋亡的发生。本实验为锌离子可能参与PD发病的机制提供了实验依据。

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文摘

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论文说明：缩略词表

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引言

1实验材料

1.1动物准备

1.2药剂配制

1.3实验仪器

2实验方法

2.1动物分组

2.2 ICP-2测定SN内锌离子含量

2.3 Str内DA及其代谢产物含量的测定(HPLC法)

2.4电刺激内侧前脑事（MFB）

2.5 FCV测定

2.6免疫组织化学测定

2.7尼氏染色

2.8免疫荧光双标

2.9 SOD活性的测定

2.1O MDA含量的测定

2.11 caspase-3活性测定

2.12细胞色素c的释放(Western blots)

2.13统计学处理

3结果

3.1外周给与锌离子可增加SN内锌离子含量

3.2锌离子对大鼠Str内DA及其代谢产物含量的影响

3.3锌离子对大鼠Str区DA释放量的影响

3.4锌离子对大鼠SNpcTH免疫阳性(TH-ir)细胞数目的影响

3.5锌离子对大鼠SN尼氏染色阳性细胞数目的影响

3.6锌离子对大鼠中脑MDA含量的影响

3.7锌离子对大鼠中脑SOD活性的影响

3.8锌离子对大鼠SN caspase-3活性的影响

3.9锌离子对大鼠SN细胞色素c释放的影响

3.10锌离子对大鼠SN内DA能神经元凋亡的影响

讨论

结论

参考文献

综述：二价金属离子锌参与PD发病可能机制的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢