酸马奶源酵母菌代谢物对致病性大肠杆菌的抑菌作用机理研究

摘要

酸马奶是一种传统乳制品饮料，能滋养血管、舒缓心情和促进消化。研究表明酸马奶对心血管、消化系统疾病、肺结核、糖尿病、腹泻等有辅助治疗作用。酵母菌是酸马奶中的主要微生物之一，在其代谢过程中会产生具有抑菌作用的物质，如有机酸和毒素蛋白等，而有关酸马奶源酵母菌代谢物在动物上的应用，目前尚无系统的报道。因此，本试验分离筛选了酸马奶中对牛源野生致病性Escherichia coliO8有较强抑菌作用，且能产生较多抑菌物质的酵母菌菌株，并将其纯化培养后，提取得到酵母菌代谢物。研究了酸马奶源酵母菌代谢物对致病性Escherichia coli O8的体外抑菌作用机理和抑菌谱，并研究了其对感染致病性Escherichia coli O8小鼠的体内抑菌和免疫作用机理，为该类酵母菌代谢物的应用提供理论基础。
　　试验一酸马奶源产抑菌物质酵母菌的分离筛选和鉴定分离纯化后，染色法观察酸马奶中酵母菌的形态特征，生化鉴定法鉴定酸马奶中酵母菌的属，牛津杯法筛选产抑菌物质（毒素蛋白）较多的酵母菌，26S rDNA扩增法鉴定该酵母菌的种。结果表明，酸马奶中的酵母菌菌落呈乳白色，直径在0.2～1 mm之间，有放射状真假菌丝。结合生化鉴定，分离出的5株酵母菌，分属于克鲁维酵母属（Kluyveromyces），酿酒酵母属（Saccharomyces），假丝酵母属（Candida）和白冬酵母属（Leucosporidium）。其中2株酵母菌对致病性Escherichia coli O8有较强的抑菌作用，将其进一步鉴定，该2株酵母菌为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromycesmarxianus）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。
　　试验二酸马奶源酵母菌代谢物的粗提及其抑菌组分测定乙酸乙酯萃取法粗提酵母菌代谢物，高效液相色谱法测定其有机酸组成，试剂盒法测定其毒素蛋白浓度。结果表明，经提取Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae酵母菌得到的4种代谢物分别为K.marxianus pH2、K.marxianus pH8、S.cerevisiaepH2、S.cerevisiae pH8，其主要抑菌组分为有机酸和毒素蛋白。有机酸以丙酸、乳酸和抗坏血酸为主，毒素蛋白含量为68.31~74.99 mg/100 g。而且经提取得到的酵母菌代谢物具有耐热性强，与温度呈负相关和pH耐受性较强的特征。
　　试验三酸马奶源酵母菌代谢物的体外抑菌作用和抑菌谱肉汤稀释法测定Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae酵母菌的4种代谢物对致病性Escherichia coli O8的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。酶标比浊法测定了代谢物对Escherichia coli O8生长曲线的影响，微生物粘附法测定了代谢物对Escherichia coli O8细胞表面疏水性的影响，邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷法测定了代谢物对Escherichia coli O8细胞膜渗透性的影响，常规方法测定了代谢物对Escherichia coli O8电导率、细胞壁、DNA和RNA大分子物质的影响。并分析了酵母菌代谢物对常见病原菌的抑菌谱。结果表明，K.marxianus pH2、K.marxianus pH8、S.cerevisiae pH2、S.cerevisiae pH8代谢物对Escherichia coli O8的最小抑菌浓度分别为0.0250、0.1000、0.0250、0.0250 g/mL；最小杀菌浓度分别为0.1000、0.2000、0.1000、0.2000 g/mL。Escherichia coli O8生长曲线呈 S形，其细胞表面特性为强碱弱酸性及相对亲水性。该类代谢物能抑制Escherichia coliO8生长，增加Escherichia coli O8细胞表面疏水性和细胞膜渗透性，破坏其细胞膜和细胞壁的完整性，使细胞质外渗，增加菌液中碱性磷酸酶的含量和菌液的电导率。另外，该类酵母菌代谢物具有较广的抑菌谱。
　　试验四酸马奶源酵母菌代谢物的体内抑菌作用
　　一、Escherichia coli O8对小鼠的致病规律选取昆明系小鼠144只，随机分为18组，每组8只，其中9组为对照组，9组为试验组。测定时间分别为0、2、4、8、12、24、36、48、72 h。对照组小鼠注射无菌PBS后采集不同时间点的小肠组织样品；试验组小鼠注射50％致死剂量Escherichia coli O8菌悬液，观察不同时间点小鼠临床症状并采样，常规制备石蜡切片，HE和 PAS染色后观察小肠病理切片。结果表明，与对照组相比，试验组小鼠感染Escherichia coli O8后0~72 h之间，小肠绒毛长度、V/C（绒毛长度/隐窝深度）比值、肌层厚度、肠上皮淋巴细胞和杯状细胞数量先减小后增大，隐窝深度先增大后减小。注菌后36 h小鼠感染最严重，72 h开始恢复。
　　二、防治小鼠感染Escherichia coli O8酸马奶源酵母菌代谢物最优剂量的筛选选取昆明系小鼠150只，随机分为15组，每组10只，分别为空白对照组，阴性对照组，阳性对照组，K.marxianus pH2、K.marxianuspH8、S.cerevisiae pH2、S.cerevisiae pH8高、中、低剂量组。空白对照组和阴性对照组小鼠灌胃无菌PBS7 d；阳性对照组小鼠灌胃环丙沙星7 d，剂量为0.13 g/kg·bw；K.marxianus pH2、K.marxianus pH8、S.cerevisiae pH2、S.cerevisiae pH8组小鼠灌胃高、中、低剂量的4种代谢物7 d，分别为10000、5000、2500mg/kg·bw；除空白对照组外，其他组于第4 d注射50%致死剂量的Escherichia coli O8菌悬液。结果表明，K.marxianus pH2低剂量、K.marxianus pH8中剂量、S.cerevisiae pH2低剂量、S.cerevisiae pH8低剂量小鼠存活率较高，表明低剂量（2500 mg/kg·bw）的酵母菌代谢物为最优灌胃剂量。
　　三、酸马奶源酵母菌代谢物防治小鼠感染Escherichia coli O8的效果选取昆明系小鼠464只，随机分为8组，每组58只。分别为空白对照组，阴性对照组，阳性对照组，蒙药复方组（剂量为25 g/kg·bw），K.marxianus pH2、K.marxianus pH8、S.cerevisiae pH2和S.cerevisiae pH8组（剂量为2500 mg/kg·bw），处理同前。流式细胞术测定小鼠外周血淋巴细胞及其亚群，ELISA法测定小鼠血清中细胞因子和酶，称重法测定小鼠脏器指数，细胞培养法测定小鼠NK细胞活性，平板涂布法测定小鼠盲肠微生物数量，碳廓清法测定小鼠巨噬细胞吞噬功能，并测定小鼠存活率。结果表明，阴性对照组小鼠注射Escherichia coli O8后，各指标出现不同程度变化，机体盲肠菌群失调，免疫能力降低，抗病力下降。4种酵母菌代谢物组、阳性对照组和蒙药复方组可以不同程度维持小鼠正常盲肠微生物比例，提高机体的免疫机能和存活率。
　　综合得出：酸马奶源酵母菌代谢物对致病性Escherichia coli O8有较好的抑菌效果，能提高感染牛源致病性Escherichia coli(E.coli)O8小鼠的免疫机能和抗病力。

目录

声明

缩 略 语 表

1 引言

1.1酸马奶研究现状

1.2酵母菌研究概述

1.3 微生物代谢物概述

1.4 致病性大肠杆菌的危害性

1.5课题研究的目的和意义

1.6主要研究内容和技术路线

2 酸马奶源产抑菌物质酵母菌的分离筛选和鉴定

2.1试验材料

2.2 试验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5结论

3酸马奶源酵母菌代谢物的粗提及其抑菌组分测定

3.1酵母菌代谢物的粗提

3.2酵母菌代谢物的抑菌组分测定

4酸马奶源酵母菌代谢物的体外抑菌作用和抑菌谱

4.1酵母菌代谢物的体外抑菌作用

4.2酵母菌代谢物的抑菌谱

5酸马奶源酵母菌代谢物的体内抑菌作用

5.1E. coli O8对小鼠的致病规律

5.2防治小鼠感染E. coli O8酸马奶源酵母菌代谢物最优剂量的筛选

5.3酸马奶源酵母菌代谢物防治小鼠感染E. coliO8的效果

6总体讨论

7总体结论

8创新点

致谢

参考文献

附 图

作 者 简 介