内蒙古地区牛源致病链球菌的耐药性、毒力特征分析及其两者的相关性研究

摘要

奶牛养殖业中常见的奶牛乳房炎和子宫内膜炎的发生能降低奶牛产奶量和牛奶品质，也可导致奶牛繁殖能力下降甚至影响受胎率。内蒙古是我国主要的畜牧业生产基地之一，但这些常见疾病的发生给畜牧业发展带来了严重的经济损失。细菌感染是引发临床牛源性疾病的重要因素，牛源链球菌是引发奶牛细菌性疾病的主要病原菌之一，其所含的致病因子与奶牛炎症的发生与流行有关。临床中常采用抗菌药物治疗奶牛疾病，长期使用这些抗菌药物，并且普遍存在抗菌药物的不合理使用现象，这致使牛源致病链球菌对抗菌药物的耐药性逐渐增加。因而，开展牛源致病链球菌临床常用抗菌药物的耐药性研究，并对其耐药机理的深入了解，这对奶牛链球菌病的防控具有很重要的现实意义。本研究通过开展内蒙古地区牛源致病链球菌及其毒力基因在各菌种间的分布情况调查，探讨链球菌在引发奶牛细菌性疾病发生过程及传播途径中存在的致病作用；同时，开展临床中分离的牛源链球菌对兽医临床常用药物的耐药性及其机制的研究，可为内蒙古地区牛源致病链球菌耐药性产生的原因，以及临床中对该菌属细菌的防控提供了详实的实验依据与合理的用药方案；在此基础上，通过开展敏感链球菌体外诱导耐药及耐药质粒接合试验研究，进一步分析该地区牛源致病链球菌耐药性与毒力特征之间的关系，阐明内蒙古地区牛源致病链球菌耐药性发生的变化是否与其毒力特征存在相关性，以期为牛源致病链球菌耐药性的风险评估以及控制或减少由该菌属细菌感染的奶牛疾病奠定理论基础。
　　（1）对内蒙古不同地区临床中奶牛乳房炎及子宫内膜炎的360份病料，采用微生物分离鉴定的方法，应用sodA基因进行PCR扩增，对疑似链球菌进行了分离及分子水平鉴定。该试验结果显示，从内蒙古不同地区采集的360份病料中，共分离鉴定到116株牛源链球菌，总体分离率达到32.2％。其中分离到无乳链球菌（S.agalactiae）78株（67.2%），停乳链球菌（S.dysgalactiae）21株（18.1%）以及乳房链球菌（S.uberis）17株（14.7%）。各地区链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌的分离率差异均不显著(P>0.05)。
　　（2）采用PCR法对临床分离链球菌的8种常见毒力基因进行调查。该部分试验结果显示，bac基因编码的β-抗原在所有分离菌株中均未检测到，其余7种毒力基因广泛分布于链球菌属的各个菌种间。其中编码β-溶血素的cyl基因检出数最多(58株/50.0%)，其次为hylB(56株/48.3%)， glnA(52株/44.8%)以及cfb(51株/44.0%)基因。同时发现15种不同的毒力基因组合，携带cyl+hylB+cfb+glnA基因型的菌株最为流行(34株/29.3%)。
　　（3）釆用CLSI推荐的微量肉汤稀释法，测定23种兽医临床常用于治疗奶牛疾病的抗菌药物对内蒙古地区临床分离链球菌的最小抑菌浓度。该部分试验结果表明，分离链球菌在对23种抗菌药物的敏感性检测中，对β-内酰胺类药物的耐药率最高，耐药率在80.3%～96.6%之间；对四环素类和大环内酯类抗生素的耐药率在42%～85%之间；对克林霉素耐药率(60%以上)也偏高；对氟喹诺酮类、氯霉素和万古霉素相对敏感，其中左氧氟沙星耐药率仅2.6%。116株内蒙古地区牛源致病链球菌中共发现有102株多重耐药菌(87.9%)。采用PCR法对β-内酰胺类、四环素类及大环内酯类的耐药菌株进行了分子机制调查。试验结果显示，该地区β-内酰胺类耐药菌株产生的主要分子机制是青霉素结合蛋白变异（PBPs）所致；四环素类耐药菌株的耐药机制是由tetL介导的外排机制与tetM基因介导核糖体保护两种分子机制贡献；大环内酯类耐药菌株的耐药机制是由ermB基因介导的核糖体甲基化。
　　（4）采取体外逐渐增加药物浓度的方法诱导肺炎链球菌标准菌株ATCC49619及临床分离红霉素敏感菌株耐药。试验结果表明，肺炎链球菌ATCC49619及15株临床分离敏感菌在诱导10代和12代时产生高耐性，MIC≥64μg/mL，耐药子代在无药培养基中传代5次，MIC未发生改变，表明诱导耐药株耐药性稳定。诱导耐药菌株经PCR检测，93.8%检测到ermB基因，表明诱导耐药的分子机制主要与抗生素结合的核糖体靶位发生甲基化有关。
　　（5）采用滤膜结合法开展质粒接合试验。供体菌为临床分离高耐四环素的链球菌20株，受体菌为诱导耐药后的肺炎链球菌ATCC49619-ERY。质粒接合试验表明，四环素的高耐性可以传递到肺炎链球菌ATCC49619-ERY，每一菌种之间转移率达100%；接合子获得了供体菌的耐药表型及相关耐药基因。
　　（6）选择诱导耐药和质粒接合的部分菌株，经过耐药性及毒力基因筛选，通过对小鼠LD50的测定，分析链球菌耐药性与毒力特征的相关性。试验结果显示，诱导耐药组中青霉素诱导耐药的停乳链球菌CVCC3701-PEN与亲本株比较，LD50值比诱导前升高了1.1×102倍；质粒接合组中接合子的LD50与受体菌比较升高了1.6倍，表明敏感菌在获得耐药性后毒力均有所下降。
　　本研究得到的主要结论如下：
　　（1）链球菌属细菌的各个菌种在内蒙古地区奶牛乳房炎和子宫内膜炎的病原菌中分布广泛，其中无乳链球菌是所有分离链球菌的优势菌种。
　　（2）多种毒力因子广泛的分布于内蒙古地区奶牛乳房炎和子宫内膜炎的链球菌中，有60.3%的牛源链球菌至少携带一种毒力因子，且毒力基因型复杂。
　　（3）内蒙古地区分离的牛源链球菌对兽医临床常用抗菌药物产生严重的耐药性，这可能是导致该地区奶牛乳房炎及子宫内膜炎频发及抗菌药疗效不理想的主要原因之一。
　　（4）内蒙古地区分离的红霉素敏感链球菌及肺炎链球菌ATCC49619经红霉素体外诱导耐药，MIC值由≤0.5μg/mL上升至≥64μg/mL，且均携带ermB或mefA耐药基因。
　　（5）内蒙古地区分离的高耐四环素链球菌经质粒接合试验可将其耐药性转移，转移率达100%；接合子获得了供体菌的耐药表型及相关耐药基因。
　　（6）质粒接合中的接合子的LD50与受体菌比较，青霉素诱导耐药的停乳链球菌CVCC3701-PEN与亲本株LD50比较，敏感菌在获得耐药性后毒力均有不同程度降低。

目录

前言

1奶牛乳房炎相关研究进展

2 奶牛子宫内膜炎研究进展

3牛源致病链球菌的研究进展

4链球菌耐药性的研究进展

5耐药基因水平传递的研究方法

6链球菌毒力特征研究进展

7致病链球菌耐药性与毒力特征的相关性研究进展

8本研究的目的和意义

第一章 内蒙古地区牛源链球菌的分离、鉴定及毒力基因的分布研究

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 小结

第二章 内蒙古地区牛源致病链球菌耐药性研究

1试验材料

2试验方法

3 试验结果

4 讨论

5 小结

第三章 内蒙古地区牛源致病链球菌耐药性与毒力特征的相关性研究

1 内蒙古地区牛源致病链球菌中红霉素敏感菌株耐药性的诱导试验

2 内蒙古地区牛源致病链球菌耐药质粒接合试验

3 内蒙古地区牛源致病链球菌耐药前后毒性的测定

4 讨论

5 小结

全文讨论

全文结论

创新点

致谢

参考文献

作 者 简 介