Pin1与CyclinD1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义

摘要

前言肿瘤的发生是在基因和基因上水平多步骤、多因素的过程，最终导致不可控制的细胞增殖、转化和死亡。在细胞增殖和转化中，主要的调节机制是由多种蛋白激酶指导的丝/苏-脯氨酸的磷酸化，如：周期素依赖激酶。蛋白中磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序存在顺/反两种构型，这种构型的改变通常为磷酸化所抑制，但能够特异地被Pin1(人类肽基脯氨酰顺反异构酶)催化，Pin1通过与磷酸化的丝/苏-脯氨酸位点结合引起构象改变，使其活化。Pin1的催化活性引起的构象改变是在蛋白磷酸化之后，所以，这种构型的改变在催化活性、蛋白的去磷酸化、蛋白和蛋白之间的相互作用、亚细胞的定位、细胞信号转导途径和生长的调控中起着重要作用。因此，磷酸化依赖Pin1的调节机制是一个新的重要的信号转导机制。 Pin1在正常组织中表达有限，而在多种肿瘤组织中的表达则明显高于其来源的正常组织，而且这种改变与临床分期、临床预后密切相关。目前关于Pin1在肺癌组织中的表达情况及其与CyclinD1的相互关系的研究甚少，为此，本实验对肺鳞癌和肺腺癌及其癌旁正常肺组织中的Pin1和CyclinD1的表达情况进行研究，并分析二者与临床病理因素的关系，以探讨它们在肺癌发生发展中的作用与意义。 材料与方法1.材料45例肺鳞癌和24例肺腺癌及癌旁正常组织来自辽宁省肿瘤医院1980年～2001年和中国医科大学附属第一临床医院胸外科2005年5月～2005年8月手术手术切除存档蜡块。组织均经4％甲醛固定，常规石蜡包埋。其中的10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁正常组织用于WesternBlot。 2.主要试剂和来源实验药品：浓缩型兔抗人Pin1多克隆抗体、即用型CyclinD1单克隆抗体、梯度蛋白标准均购自美国SantaCruze公司；即用型S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-action一抗和浓缩型辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 3.方法3.1免疫组织化学染色：检测Pin1和CyclinD1的表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)。结果判定：(1)Pin1蛋白表达定位于细胞浆和(或)细胞核。根据其染色强度计分：无染色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；按染色阳性细胞百分率计分：阳性细胞百分率＜25％者为0，阳性细胞百分率25％～49％者为1，阳性细胞百分率50％～74％者为2，≥75％者为3。最后判断标准为上述两项得分相乘，得分≥3分为过度表达。(2)CyclinD1蛋白表达定位于细胞浆和(或)细胞核，无明显阳性细胞为阴性(-)，阳性细胞数小于20％为弱阳性(+)，阳性细胞数大于20％为阳性(++)。其中弱阳性表达(+)归入阴性(-)中。 3.2WesternBlot：检测Pin1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达。取新鲜样品(1-2克)加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的棕色条带，并对蛋白条带作灰度值测定。 4.统计学分析应用PEMS3.1医学统计软件，对Pin1和CyclinD1的表达与临床病理特征的关系用卡方检验，P≤0.05为有统计学意义。 结果1.Pin1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达Pin1在癌旁正常肺组织不表达或呈微弱的核表达。在肺鳞癌和肺腺癌癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。 WesternBlot结果显示：Pin1在10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 2.CyclinD1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达CyclinD1正常肺组织不表达。在肺鳞癌和肺腺癌癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。 WesternBlot结果显示：CyclinD1在10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 3.Pin1、CyclinD1蛋白的表达与肺鳞癌、肺腺癌的临床病理特征关系免疫组化结果显示，Pin1的表达与患者的性别、年龄、组织类型、分化、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。CyclinD1的表达与分化程度负相关(P=0.0274)，而与患者的性别、年龄、组织类型、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。Pin1和CyclinD1二者的表达呈显著正相关(P=0.0048)。 讨论丝\苏-脯氨酸残基的磷酸化是调节细胞增殖和转化的主要机制。例如：信号转导通路被癌基因Neu/Ras活化的多种脯氨酸蛋白激酶激活，最终经由多种转录因子包括：E2F、c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB而加强CyclinD1的转录，并且CyclinD1的稳定性由后转录磷酸化位点Thr-286-pro调控。丝\苏-脯氨酸基序的结构和功能进一步为脯氨酰异构酶Pin1所调节。因此，依赖Pin1的特异磷酸化是一个新的重要的信号机制。 CyclinD1在肿瘤的发生中起关键作用，CyclinD1的敲出能够抑制Ha/Ras或c-Neu/HER2/EerB2引起的鼠的乳腺癌的发生。这些结果暗示：CyclinD1是Neu/Ras引起的肿瘤，发生机制中必不可少的下游靶点，一个重要机制是丝\苏-脯氨酸基序的磷酸化。我们已经发现Pin1在人类许多肿瘤中过表达，它的表达水平与CycinD1的水平密切相关。更为重要的是Pin1能够通过激活c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB转录因子而提高CyclinD1的表达水平，Pin1也可直接结合CyclinD1磷酸化的Thr286-Pro位点，并通过抑制其入浆而稳定CyclinD1。除此之外，在除去Pin1成年女性，乳腺上皮失去伴随怀孕的强增殖能力，表型和除去CyclinD1相似。最后，经由E2F的Neu/Ras信号途径加强Pin1的转录。Pin1的转录也促进Neu/Ras转染乳腺上皮的转化表型。这些结果提供了体内体外证据证实了Pin1在早期肿瘤发生中尤为重要的作用和其吸引人的抗癌靶点。 本研究中，Pin1和CyclinD1在肺鳞癌和肺腺癌中过度表达，且Pin1与CyclinD1在肺癌中的表达显著正相关。我们实验证实了Pin1是Neu/Ras激活的经由CyclinD1信号转导途径中的关键因子，所以Pin1是肿瘤发生中必不可少的关键因素。 结论1.Pin1在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织，CyclinD1在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 2.Pin1的表达与患者的性别、年龄、组织类型、分化、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。CyclinD1的表达与分化程度负相关，而与患者的性别、年龄、组织类型、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。 3.Pin1与CyclinD1在肺癌中的表达显著正相关。

目录

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中文论著摘要

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英文缩略语

前 言

材料和方法

实验结果

讨 论

结 论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综 述 Pin1与细胞周期的调控及人类肿瘤的关系

在学期间科研成绩

致 谢

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