去甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂对前列腺癌细胞株雌激素受体的影响

摘要

表观遗传学被描述为没有DNA序列变化、可遗传的表达改变。研究表明表观遗传学改变在肿瘤发生中扮演一个重要角色，肿瘤发生中的主要表观遗传学改变是抑癌基因发生DNA异常甲基化和染色质中的组蛋白修饰。表遗传改变也是一个致癌事件，但是与遗传学改变不同的是，表遗传学的改变是可逆的。通过使用DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶(HADC)抑制剂可以使表遗传静止的基因恢复活性，从而逆转肿瘤的恶性表型或延缓肿瘤的进展。表遗传修饰可逆的特性提示它可作为肿瘤患者进行治疗的靶标。 DNA甲基化调节基表达及某些抑癌基因高甲基化失活与肿瘤发生相关的理论已得到广泛认同。DNA甲基化调节基因表达与组蛋白去乙酰化的作用密切相关。DNA甲基化可诱导局部组蛋白脱乙酰化，使染色质乙酰化水平降低，且甲基化的序列可募集甲基CpG结合蛋白(MeCP)与组蛋白去乙酰化酶(HADC)复合物(MeCP—HADC)，发挥对基因表达的抑制作用。因DNA甲基化失表达的抑癌基因能否通过去甲基化制剂或/和HDAC抑制剂的作用重新表达为本次研究的目的。 雌激素受体属于配体激活的核转录因子超家族的一员。分为二型，ERα和ERβ；ERα位于前列腺基底上皮细胞和基质间隙，ERβ位于前列腺腺体上皮间隙，目前认为雌激素对于前列腺上皮的作用是通过ERβ信号途径。Pasquali等研究表明在前列腺癌中没有发现ERβ表达。然而，Leav等报道ERβ在高级别发育异常中免疫活性减少，但在高级别肿瘤和转移性前列腺癌中重新出现，进而有人认为同乳腺癌一样，前列腺癌中即使有表达的ERβ可能是野生型ERβ的变异体，ERβ具有调节细胞生长抑制的作用，其发生变异突变可能导致抗雌激素治疗不敏感或使癌细胞更具侵袭性。而目前绝大多数免疫组化染色研究仅仅用一种ERβ抗体，难以区分其他各种ERβ亚型的蛋白表达情况。相关研究表明ERβ在大多数前列腺癌中表达缺失显示ERβ可能是潜在的肿瘤抑制基因，可能是治疗前列腺癌的理想目标。 在前列腺癌细胞株与前列腺癌组织中广泛存在雌激素受体(ER)基因的甲基化，甲基化的程度与肿瘤病理级别呈正相关，与ER基因的表达呈负相关，虽然在前列腺增生组织中也存在ER甲基化，但明显低于前列腺肿瘤。在前列腺癌中，目前可畿的一个使ER基因失活的原因就是ER基因启动区域的CpG岛甲基化，通过一些尚不明了的机制导致ER基因转录失活。 为了研究前列腺癌细胞中雌激素受体β的表达情况与DNA甲基化酶抑制剂和HDAC抑制剂的作用是否有关联，本实验通过DNA甲基化酶抑制剂5—杂氮—2’—脱氧胞苷(5’—aza—2’—deoxycytidine，5—AZAC)和HDAC抑制剂曲古抑霉素A(Trichostatin A，TSA)作用于前列腺癌细胞系Du145、PC—3和22RV，检测细胞凋亡情况；应用荧光实时定量PCR检测细胞中雌激素受体β的表达情况，观察其是否上调，为前列腺癌的临床治疗提供基础。 方法: 一．材料与主要试剂 雄激素非依赖性前列腺癌细胞Du145、PC—3和雄激素依赖性前列腺癌细胞22RV购于中科院上海细胞库；5—杂氮—2’—脱氧胞苷(美国Sigma公司)，曲古抑霉素A(美国Sigma公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)，二亚基亚矾(美国Sigma公司)，Trizol(美国Gibco公司)，SBRY—Green(天根)，Master—mix(天根)。 二．实验方法 1.细胞培养 Du145和22RV细胞以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，PC—3以含10％胎牛血清的HAM/F—12培养基于37℃、5％ CO2培养箱中培养，每3～4d消化传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。 2.MTT检测5—AZAC和TSA对前列腺癌细胞的影响 检测不同药物浓度的5—AZAC和TSA以及5—AZAC和TSA共同作用的前列腺癌细胞的细胞生存率。细胞生存率(％)=(实验组A值—空白组A值)/(阴性对照组A值—空白组A值)×100％。实验重复3次。 3.实时荧光定量PCR检测5—AZAC和TSA作用后的前列腺癌细胞雌激素受体β的表达 收集经不同药物处理或未处理的细胞，Trizol提取总RNA，应用TaKaRa公司的RT-PCR试剂盒和SBRY—Green检测雌激素受体β的表达。 4.统计学分析 所有数据采用SPSS11.6软件包进行处理，取p<0.05具有统计学意义。 结果: MTT检测发现5—AZAC和TSA处理后的前列腺癌细胞株生存率降低，在一定范围内随着剂量的增高，前列腺癌细胞生存率降低的越明显；5—AZAC和TSA联合作用时前列腺癌细胞的生存率最低。 实时荧光定量PCR显示三种前列腺癌细胞经过5—AZAC和TSA作用后，mRNA ERβ表达量增加，并且随着药物浓度的增大，mRNA ERβ表达量越多；5—AZAC和TSA联合作用mRNA ERβ表达量比单独作用都多出1倍左右。 结论: 5—AZAC和TSA对前列腺癌细胞的生长起抑制作用，在一定范围内随着剂量的增高，对前列腺癌细胞增殖的抑制作用越明显；TSA对细胞的抑制作用强于5—AZAC；5—AZAC和TSA联合作用时抑制作用强于单独药物作用。 5—AZAC和TSA都可以诱导前列腺癌细胞的ERβ表达上调，从而抑制了前列腺癌细胞的生长。

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综述 表观遗传学与前列腺癌

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