miR-200c基因甲基化检测方法的建立及其在乳腺癌标本中的应用

摘要

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类单链非编码小分子RNA，其通过与靶mRNA的3’端非翻译区结合，引起靶mRNA降解或者翻译抑制，产生转录后基因沉默，从而调控基因的表达。已有大量研究表明，miRNA基因的表达和蛋白编码基因一样受到表观遗传调控，其表达下调可能与miRNA启动子区CpG岛的甲基化有关。miR-200c是与乳腺癌转移密切相关的miRNA，尽管miR-200c基因的甲基化与多种肿瘤的发生、发展有关，但限于miR-200c基因关键性CpG位点的确认尚存争议，以及检测方法的局限性，使得miR-200c基因的甲基化检测在组织标本中的应用尚未得到普遍的开展。
　　目的：
　　确认miR-200c基因甲基化的的关键性CpG位点；建立miR-200c基因甲基化检测的定性与定量MSP分析方法，并应用于乳腺癌组织标本的分析。
　　方法：
　　采用原位miRNA杂交技术检测miR-200c在乳腺病变组织中的表达；去甲基化药物5-Aza-CdR对四种乳腺癌细胞株进行处理，qRT-PCR方法检测乳腺癌细胞中miR-200c的表达水平；运用在线软件预测miR-200c基因启动子区的CpG岛；亚硫酸氢钠修饰后克隆测序对5-Aza-CdR处理的乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛11个CpG位点进行检测；建立MSP与dHPLC方法检测乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛甲基化水平；应用MSP定性与定量方法对乳腺癌癌灶组织和癌旁组织检测miR-200c基因CpG岛甲基化。
　　结果：
　　1、原位杂交结果显示，乳腺癌组织中 miR-200c表达与正常和良性乳腺病变组织相比，并无统计学差异；
　　2、qRT-PCR结果显示；与0μmol/L对照组相比，5μmol/L的5-Aza-CdR处理组中BT549与MDA-MB-231细胞株的miR-200c水平明显增高（p<0.05），而MCF7与T47D细胞的miR-200c水平变化不大；
　　3、网站预测结果显示，在 miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛，包含11个CpG位点；
　　4、亚硫酸氢钠克隆测序结果显示，0μmol/L的5-Aza-CdR对照组中，miR-200c表达高的MCF7和T47D细胞株miR-200c基因11个CpG位点甲基化频率与甲基化总频率明显低于miR-200c表达低的BT549和MDA-MB-231细胞株；
　　5、建立的MSP与dHPLC方法验证了miR-200c基因CpG岛在MDA-MB-231细胞株中高甲基化与MCF7细胞株中低甲基化；
　　6、乳腺癌组织定性和定量MSP结果分析提示，miR-200c基因的甲基化频率在癌灶组与癌旁组中未见统计学差异。
　　结论：
　　1、miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛，此区域为关键性甲基化区域，该区域的CpG位点甲基化状态与miR-200c的表达有着紧密关联；
　　2、建立的定性 MSP与 dHPLC方法能特异性区分乳腺癌细胞株 miR-200c基因CpG岛甲基化状态，为后续乳腺癌组织标本的检测提供了便利。

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中英缩略词表

第1章 引言

第2章 实验材料、仪器与试剂

2.1 细胞、临床标本和组织芯片

2.2 主要仪器

2.3 主要试剂

第3章 实验方法

3.1主要试剂的配制

3.2 乳腺癌组织miR-200c原位杂交

3.3细胞培养

3.4 CpG岛预测

3.5 RNA提取、miRNA逆转录与实时荧光定量-PCR

3.6 真核细胞DNA的提取

3.7 亚硫酸氢钠甲基化修饰DNA

3.8 TA克隆测序

3.9 盐析法从石蜡包埋组织中提取DNA

3.10 定性MSP

3.11 定量MSP

3.12 建立dHPLC法检测乳腺癌细胞与组织中的miR-200c

3.13 统计

第4章 实验结果

4.1 乳腺组织芯片miR-200c原位杂交

4.2 5-Aza-CdR对四株乳腺癌细胞miR-200c表达的影响

4.3 miR-200c编码基因启动子CpG岛预测

4.4 BCS方法检测细胞miR-200c编码基因启动子CpG岛甲基化水平

4.5 定性MSP法验证乳腺癌细胞miR-200c基因启动子区CpG岛甲基化状态

4.6 dHPLC验证乳腺癌细胞中miR-200c启动子区CpG岛甲基化状态

4.7 乳腺组织标本MSP定性分析

4.8 乳腺组织标本MSP定量分析

第5章 讨论

第6章 结论

致谢

参考文献

综述: miRNA与组蛋白修饰的关联调控与肿瘤的关系