硫磺矿硫化叶菌Orc1/Cdc6蛋白在DNA复制起始中的调控功能研究

摘要

DNA复制是生命现象最本质的内容，是由众多蛋白共同参与的能确保遗传信息精确及时传递的复杂的生物学过程。古菌是一类区别于真核生物与真细菌的第三域生命形式，最近的研究表明它们的DNA复制系统与真核生物类似，而且更为简单。因此，对古菌DNA复制的研究能够为最终阐明高等真核生物复杂的DNA复制机制提供重要线索。
　　 Cdc6和MCM是与真核生物DNA复制起始有关的两种蛋白。已经报道极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的环状染色体含有三个活性复制原点，其基因组编码三个Orc1/Cdc6同源蛋白(SsoCdc6-1、-2和-3)和一个MCM复制性解旋酶同源蛋白(SsoMCM)。尽管硫化叶菌有巨大潜力作为一种模式菌株来研究真核生物的重要复制机制，但目前有关古菌和真核生物复制起始蛋白如何介导原点DNA的解链以及复制起始复合物形成等有关的分子细节还很不清楚。本研究依据硫磺矿硫化叶菌两个复制原点oriC1和oriC2的结构特征，设计了三组分别具有平端和分叉结构的特异性DNA底物，通过EMSA、细菌双杂交以及Pull-down/western blot等试验，对S. solfataricus三个Orc1/Cdc6同源物之间以及它们与MCM、polB1和SSB之间的物理和功能相互作用进行了系统的研究，主要取得了的以下四个方面的研究结果：
　　 1.三个SsoCdc6差异性结合原点特异性DNA分子：SsoCdc6-1和-3不仅以结构特异性而且以序列特异性方式结合原点DNA底物。SsoCdc6-1对oriC1起源的DNA底物有较高的结合活性，对其平端底物的结合能力略高于分叉底物。SsoCdc6-3对oriC2起源的两种结构的DNA底物都有较高的结合活性，低浓度下结合分叉底物的能力高于平端底物，高浓度下没有明显的差异。而SsoCdc6-2对于三组DNA底物的结合活性没有表现出明显的序列特异性，但总体对平端底物的结合能力低于分叉结构DNA。另外，利用EMSA实验分析我们发现三个SsoCdc6 C-末端WH结构域缺失的突变体在体外也能结合原点特异性DNA底物，但是比全长的蛋白结合能力明显减弱。我们推测不仅SsoCdc6 C-端WH结构域，N-端结构域和DNA序列也会影响它们结合DNA的能力。
　　 2.三个SsoCdc6可以通过其N-端催化结构域发生物理和功能相互作用并且这种相互作用对它们的原点DNA结合活性有调控作用：细菌双杂交和Pull-down/westernblot实验表明三个SsoCdc6之间可以通过其N-端结构域相互作用；EMSA试验表明SsoCdc6-1刺激SsoCdc6-3原点DNA结合活性，而且三者可能形成较大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-3/DNA复合物。相反SsoCdc6-3和SsoCdc6-1都分别抑制SsoCdc6-2的DNA结合活性，而且SsoCdc6-1能和SsoCdc6-2相互作用形成大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-2/DNA复合物。这些结果表明这些复制起始蛋白可能在功能上相互作用并调控彼此在原点上的集结，作为预复制复合体(Pre-RC)的组件共同发挥作用来调控DNA复制的起始。
　　 3.三个SsoCdc6通过不同的结构域和SsoMCM相互作用，并且这些相互作用在调控SsoMCM募集到原点DNA过程中起着重要的作用：细菌双杂交和Pull-down/western blot以及EMSA实验表明SsoCdc6-2通过其C-端结构域和SsoMCM相互作用，并促进SsoMCM加载到原点DNA上。相反，SsoCdc6-1和-3通过其N-端结构域和MCM相互作用，并抑制SsoMCM和原点DNA的结合。虽然三个SsoCdc6蛋白都可以和SsoMCM解旋酶相互作用，相对SsoCdc6-1和-3，SsoCdc6-2和SsoMCM的相互作用要更紧密一些，并可能在解旋酶加载方面起作用。
　　 4.细菌双杂交分析S.solfataricus Cdc6、DNA聚合酶polB1、MCM以及SSB之间的物理相互作用，结果表明：SsoCdc6-1△C/SsopolB1、SsoCdc6-3/SsopolB1、SsoCdc6-2/SsoSSB、SsoCdc6-3/SsoSSB、SsoSSB/SsoMCM、SsopolB1/SsoMCM和SsopolB1/SsoSSB之间存在物理相互作用。
　　 总结以上研究结果我们推测，S.solfataricus三个SsoCdc6在DNA复制早期过程中可能扮演不同角色，但它们之间能够相互协作共同调控DNA复制原点的起始。编码SsoCdc6-1和SsoCdc6-3的基因分别与复制原点oriC1和oriC2相邻，可能在特异性识别原点中起作用，因而可以是真核生物ORC和细菌DnaA的功能同源物；而SsoCdc6-2编码的基因与编码SsoMCM的基因相邻而不与任何一个复制原点相邻可能负责MCM的加载，因而可能是真核生物Cdc6和细菌DnaC的同源物。我们的这些重要的结论已经对古菌和真核生物DNA复制起始机理的认识提供了重要线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

1前言

1.1古菌概述

1.1.1古菌的多样性及分类

1.1.2古菌的细胞结构、遗传特性及基因组特征

1.1.3古菌的应用价值

1.1.4极端嗜热古菌和硫化叶菌概述

1.2 DNA复制起始

1.2.1 DNA复制原点

1.2.2原点识别复合物ORC和Cdc6蛋白

1.2.3 DNA复制性解旋酶-微染色体维持蛋白(MCM)

1.2.4单链DNA结合蛋白

1.2.5其它DNA复制起始蛋白

1.2.6 DNA复制的起始及其调控

1.3蛋白质/核酸相互作用研究方法进展

1.3.1 DNase I足迹试验

1.3.2凝胶电泳迁移率分析

1.3.3染色质免疫沉淀技术

1.3.4核酸适体技术

1.3.5表面等离子共振技术

1.3.6扫描探针显微镜技术

1.4蛋白质和蛋白质相互作用研究

1.4.1蛋白质亲和纯化分析

1.4.2免疫共沉淀

1.4.3交联技术

1.4.4酵母双杂交系统

1.4.5细菌双杂交系统

1.5本研究的选题依据、目的及内容

1.5.1选题依据

1.5.2研究的目的及意义

1.5.3本研究的思路和内容

2材料和方法

2.1材料

2.1.1供试菌株

2.1.2供试质粒

2.1.2酶、试剂和试剂盒

2.1.3寡核苷酸

2.1.4培养基

2.1.5抗生素

2.1.6缓冲液与试剂的配制

2.2方法

2.2.1 S.solfataricus P2的培养

2.2.2 S.solfataricus P2基因组DNA提取

2.2.3 PCR扩增反应

2.2.4分子生物学基本操作方法

2.2.5表达载体的构建

2.2.6蛋白的表达、纯化及蛋白浓度测定

2.2.7寡核苷酸底物的同位素标记

2.2.8凝胶电泳迁移率试验(EMSA)

2.2.9 Pull-down assay

2.2.10 His-tag 融合蛋白抗血清的制备

2.2.11 His-tag融合蛋白特异性抗体的亲和纯化

2.2.12 Western-blotting 检测抗原抗体的特异性结合

2.2.13 细菌双杂交载体的构建及相互作用蛋白的筛选

2.2.14 Native-PAGE

3结果与分析

3.1 SsoCdc6与复制原点特异性DNA的相互作用研究

3.1.1 SsoCdc6-1、-2和-3氨基酸序列分析、结构预测和SsoCdc6-1KA、Cdc6-1ΔC、SsoCdc6-3KA、Cdc6-3 AC突变体的设计

3.1.2 His-tag SsoCdc6-1和-3原核表达载体的构建

3.1.3 SsoCdc6-1和-3 C-末端缺失突变原核表达载体的构建

3.1.4 SsoCdc6-1和-3定点突变表达载体的构建

3.1.5 His-tag融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3.1.6蛋白质浓度的测定

3.1.7定点突变蛋白的包涵体表达及其二级结构的预测

3.1.8原点特异性DNA底物的设计

3.1.9 SsoCde6差异性结合不同的原点特异性DNA底物

3.1.10小结

3.2 SsoCdc6之间的功能和物理相互作用研究

3.2.1表达SsoCdc6-1、-2、-3天然蛋白的重组表达载体的构建

3.2.2三个SsoCdc6及C-末端缺失突变体编码基因在双杂交载体的克隆

3.2.3 SsoCdc6天然蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3.2.4 SsoCdc6之间的功能相互作用

3.2.5 SsoCdc6 之间的物理相互作用

3.2.6小结

3.3 SsoCdc6与SsoMCM之间的功能和物理相互作用研究

3.3.1表达天然蛋白SsoMCM的原核表达载体的构建

3.3.2天然蛋白SsoMCM与His-tag SsoMCM的表达和亲和纯化

3.3.3 SsoMCM和oriC2序列特异性DNA底物之间的相互作用

3.3.4 SsoMCM和SsoCdc6的功能相互作用

3.3.5 SsoMCM和SsoCde6的物理相互作用

3.3.6小结

3.4 SsoCdc6与S.solfataricus DNA聚合酶(polB1)和单链结合蛋白(SSB)之间的相互作用研究

3.4.1 His-tag SsopolB1原核表达载体的构建

3.4.2 ssopolbl在细菌双杂交载体的克隆

3.4.3 His-tag SsoSSB原核表达载体的构建

3.4.4 ssossb在细菌双杂交载体pBT和pTRG的克隆

3.4.5 SsopolB1和SsoSSB His-tag融合蛋白的表达和亲和纯化

3.4.6细菌双杂交筛选SsoCdc6和SsopolB1的物理相互作用

3.4.7细菌双杂交筛选SsoCdc6和SsoSSB的物理相互作用

3.4.8小结

4讨论

4.1 SsoCdc6 N-端存在特异序列在结合原点DNA过程中起重要作用?

4.2三个SsoCdc6如何调控DNA复制的起始?

4.3 SsoCdc6之间相互作用不稳定?

4.4 SsoCdc6-2是SsoMCM的加载者?

4.5 SsoCdc6-1、-2和-3在DNA复制起始过程中发挥不同的作用?

4.6 SsoCdc6-3在DNA复制起始后期和延伸阶段也发挥一定的作用?

5本研究的创新性成果与下一步工作设想

5.1本研究的创新性成果

5.2下一步工作设想

参考文献

论文发表情况

致谢