大肠埃希菌复制起始蛋白DnaA可逆乙酰化修饰对DNA复制起始调控的研究

摘要

对大部分生命体来说，染色体的复制起始和调节是重要的生命活动。能否正确地进行复制起始决定了细胞的命运。细胞需要在合适的环境下开始复制起始，又必须在恶劣的环境下阻止复制起始。在细菌中，复制起始蛋白DnaA是DNA复制起始过程的关键蛋白。在E.coli中有多种机制来确保染色体正确地复制起始，其中一部分机制是通过调控ATP-DnaA的活性来实现的，包括RIDA(Regulatory inactivation of DnaA)和DARS(DnaA-reactivating sequence)等。DnaA属于AAA+蛋白家族成员，含有保守的Walker A及Walker B motifs。这两个motifs对DnaA蛋白的ATP/ADP结合至关重要。
　　近些年的研究发现，蛋白赖氨酸的乙酰化修饰在细胞的生命活动中扮演着重要的角色。我们的研究表明，DnaA可以在体外被乙酰化酶Pat及乙酰磷酸（acetyl-phosphate,AcP）乙酰化修饰，也可以被去乙酰化酶CobB去乙酰化修饰。为了更好地研究 DnaA乙酰化修饰的生理意义，我们通过knock-in的方法在E.coli基因组上dnaA的N-端敲入His标签，并通过亲和纯化的方法获得生理状态DnaA。检测生理状态DnaA乙酰化水平，我们发现E.coli WT菌株中，从迟缓期到平台期，DnaA乙酰化程度逐渐升高。与WT中DnaA乙酰化水平相比，cobB菌株中DnaA乙酰化水平上升，而pat菌株中DnaA乙酰化水平下降。AckA为乙酸激酶，可以把乙酰磷酸转化为乙酸；Pta为磷酸转乙酰酶，可以把乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A。我们构建了E.coli的ackA-pta双敲株，ackA-pta双敲株的胞内乙酰磷酸浓度较低。我们还发现，ackApta菌株中平台期DnaA乙酰化水平明显下降。细胞周期分析表明，与WT相比，cobB、pat、ackApta菌株DNA复制起始频率也发生了变化。这表明生理状态下，CobB/Pat及乙酰磷酸都参与调节了DnaA的乙酰化修饰并影响了DNA的复制起始频率。
　　通过LC/ESI/MS鉴定，我们发现生理状态下DnaA的23个赖氨酸位点中有17个位点被乙酰化修饰，其中有位于比较保守的Walker A motif上的K178位，通过质粒互补试验筛选，该位点比较重要。对该位点进行定点乙酰化修饰后检测其功能，发现DnaA(K178Ac)丧失了与ATP及ADP的结合能力，与复制起始点oriC的结合能力有很大程度的减弱。这表明，K178的乙酰化修饰可以降低DnaA的活性。而且DnaA(K178Ac)与dnaA启动子的结合能力也减弱了，这表明DnaA的乙酰化修饰有可能也参与了dnaA基因转录的自调控过程。除此之外，我们还发现K178位的乙酰化修饰可以被CobB去除。
　　以上的发现表明E.coli可以通过调节DnaA的乙酰化修饰来改变DnaA的活性进而对DNA的复制起始频率进行调节。这是一个全新的复制起始调控机制，我们的研究拓宽了人们对原核生物复制起始调控机制的认识。

目录

论文创新点

符号说明(Abbreviations)

第一章 综述

1. 概述

2. DNA的复制

3. DNA的复制起始机制

4. 细菌DNA的复制起始调控机制

5. 细菌中乙酰化修饰的研究进展

6. 本课题的研究内容和意义

参考文献

第二章 生理状态下DnaA蛋白的乙酰化修饰水平检测

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

第三章 CobB/Pat及乙酰磷酸对DnaA蛋白乙酰化修饰的调控

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

第四章 生理状态下DnaA蛋白的乙酰化修饰位点质谱鉴定及重要乙酰化赖氨酸位点的筛选

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

第五章 对DnaA蛋白乙酰化修饰位点K178位功能的研究

1. 前言

2. 材料与方法

3. 实验结果

4. 讨论

参考文献

全文总结

致谢

博士期间主要业绩

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