冷休克蛋白YB-1介导活化蛋白C对糖尿病心肌病的保护机制

摘要

研究背景及目的：
　　糖尿病是主要心血管危险因素之一，严重危害着人类的身心健康。糖尿病明显增加患者出现心力衰竭与心肌病的几率。即使是在不合并高血压与冠心病的情况下，糖尿病患者仍有风险出现心脏结构与功能异常，这种直接因糖尿病所致的心肌病称之为糖尿病心肌病。糖尿病心肌病的概念正逐渐得到广泛的认可，但糖尿病心肌病的致病机制及发生发展目前仍不完全清楚。
　　活化蛋白C(activated Protein C, aPC)一种具有抗凝以及细胞保护作用的蛋白酶，可以通过抗凋亡、抗炎及调节能量代谢对心脏缺血再灌注损伤起保护作用，也对糖尿病肾病有很强的保护作用，但是aPC是否能对糖尿病心肌病的发生发展起保护作用仍不明了。冷休克蛋白Y-box binding protein1(YB-1)是一种高度保守的核酸结合蛋白，受aPC调节，具有多种细胞效能，参与并调控了许多心脏疾病，但YB-1与aPC之间的内在联系以及在YB-1在糖尿病心肌病中扮演的角色目前并不清楚。本研究通过小鼠糖尿病心肌病模型以及相关细胞实验研究YB-1、aPC与糖尿病心肌病之间的关系。
　　方法与结果
　　我们首先构建小鼠糖尿病心肌病模型。选用C57BL/6雄性小鼠，在其8周龄时给予注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，给药方法为多次小剂量腹腔注射，60mg/kg，连续注射5天(STZ溶解于0.05M pH4.5的柠檬酸缓冲液)，对照组给予柠檬酸缓冲液腹腔注射。小鼠34周龄时终止实验。STZ注射一周后即出现血糖明显升高，以后稳步升高至平台期，提示实验早期阶段可获得稳定的I型糖尿病模型。实验终止前运用心脏超声与导管检查血流动力学评估小鼠心脏功能，结果发现糖尿病组小鼠心脏收缩、舒张功能明显低于对照组。HE染色提示糖尿病组小鼠心肌细胞明显肿胀，Western Blot结果提示糖尿病组小鼠心肌组织中ANP、BNP及β–MHC表达明显升高。这些结果说明小鼠糖尿病心肌病模型构建成功。
　　然后，我们检测发现糖尿病心肌病模型中aPC血浆含量以及心肌组织中的YB-1蛋白表达水平明显低于对照组。在细胞水平上，我们用高糖刺激H9C2心肌细胞系后ANP、BNP及β–MHC表达明显升高，而aPC预处理组ANP、BNP及β–MHC表达水平较高糖处理组显著下降。我们又进一步使用质粒及细胞转染的方法把YB-1基因Knockdown，结果发现YB-1基因的Knockdown明显减弱了aPC的细胞保护作用。这些结果说明YB-1介导aPC在糖尿病心肌病中的保护作用。
　　接着，我们使用蛋白合成抑制剂CHX抑制H9C2心肌细胞系的蛋白合成，发现aPC预处理组的YB-1蛋白降解速率明显减慢，提示aPC具有维持YB-1蛋白稳定性的作用。通过免疫共沉淀方法我们发现YB-1蛋白的减少与其泛素化有关，而aPC能减少YB-1蛋白的泛素化进而维持YB-1的蛋白水平。最后我们使用相应受体的阻滞剂与激动剂，发现aPC通过PAR-1与EPCR受体受体调节YB-1的泛素化进而调节YB-1的蛋白水平。
　　结论
　　综合以上结果，我们数据证明YB-1具有介导aPC在糖尿病心肌病模型中的细胞保护作用，其分子机制为aPC通过PAR-1与EPCR受体抑制YB-1蛋白的泛素化及其降解，从而维持了YB-1蛋白的稳定性。这为aPC与YB-1用于糖尿病心肌病的治疗提供了新的理论依据及思路。

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研究背景

第一部分活化蛋白C与冷休克蛋白YB-1在糖尿病心肌病组织中的表达

前言

实验方法

一、实验动物

二、实验用心肌细胞系

三、主要实验设备

四、实验试剂与材料

五、实验操作步骤

六、统计学方法

实验结果

一、小鼠I型糖尿病心肌病模型的建立

二、小鼠I型糖尿病心肌病模型aPC血浆浓度明显降低

三、STZ组小鼠心肌组织中YB-1的表达水平

三、高糖刺激H9C2心肌细胞系模拟糖尿病心肌病细胞模型

四、aPC逆转糖尿病心肌病细胞模型中ANP、BNP以及β-MHC蛋白的表达水平

五、aPC干预糖尿病心肌病细胞模型YB-1蛋白水平的改变

本部分小结

第二部分体外实验冷休克蛋白YB-1介导活化蛋白C改善糖尿病心肌病的机制研究

前言

实验方法

一、实验用细胞系

二、主要实验设备

三、主要实验试剂

四、实验操作步骤

五、统计学处理

实验结果

一、YB-1基因shRNA的筛选（KnockDown）

二、YB-1基因KnockDown减弱aPC对糖尿病心肌病细胞模型的保护作用

三、YB-1蛋白泛素化介导aPC对糖尿病心肌病细胞模型的调控

四、aPC通过细胞膜上PAR1受体与EPCR受体调节YB-1的表达

本部分小结

全文讨论

参考文献

综述: 冷休克蛋白YB-1的研究进展

致谢