猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选

摘要

猪圆环病毒Ⅱ型（Porcine circovirus, PCV2）是引起猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease, PCVD）的主要病原，它能损害患病仔猪的免疫系统，引发其他多种病原混合感染或继发性感染，导致猪的繁殖能力严重下降，给养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2感染的早期诊断对 PCVD的综合防控具有重大意义。目前，针对 PCV2病原的快速检测方法主要有胶体金免疫层析试纸法和ELISA检测方法等，其所用抗体主要是基于杂交瘤细胞制备的单克隆抗体，传统单克隆抗体存在生产周期长、成本高、稳定性差等缺点，在一定程度上限制了 PCV2快速、高效、廉价的检测方法的研制。而基因工程方法制备的单链抗体具有生产周期短，成本低、易于改造等优点，其有望取代传统单抗用于 PCV2新型免疫学检测方法的研制。实验的主要内容与结果如下：
　　1. PCV2 Cap蛋白的纯化及鉴定
　　本实验将重组表达载体 pET28a-ORF2转入大肠杆菌 BL21中，用 IPTG诱导表达，利用 Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化，并对蛋白进行鉴定。结果显示表达的重组蛋白分子量约26 kDa，主要以可溶形式存在，且能被 His单克隆抗体特异性识别，纯化后的重组蛋白纯度比较高。用此蛋白免疫 BALB/C鼠，免疫后，经 ELISA检测，测得鼠血清中抗体滴度达1∶64000，同时用 PCV2抗体检测试纸对鼠血清进行检测，结果为阳性。本实验制备的重组 Cap蛋白具有可溶性好、纯度高、免疫原性好等特点，为 Cap蛋白单链抗体库的构建提供了必要的实验材料。
　　2. PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选
　　选取免疫效果较好的小鼠脾脏，提取其脾脏总 RNA，再以反转录后的cDNA为模板，PCR扩增抗体的重链可变区基因（Heavy chain variable region of antibody, VH）和抗体的轻链可变区基因（Light chain variable region of antibody, VL），经重叠PCR将VH与VL用多肽(G4S)3连接，获得单链抗体基因（Single chain antibody variable region gene fragment, ScFv）。经辅助噬菌体辅助侵染后获得噬菌体单链抗体库，用 Cap蛋白作为包被原筛选 PCV2单链抗体克隆，获得3株与 Cap蛋白特异性反应的噬菌体克隆。取特异性及反应性相对较高的克隆测序，获得 PCV2单链抗体基因，并用 ELISA鉴定 ScFv-P18菌株的诱导表达后粗提物，结果显示获得的粗提物能与 Cap蛋白发生反应。
　　本研究表达并纯化到了可溶性 PCV2 Cap蛋白，并构建 PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库，筛选到具有结合活性的特异性单链抗体，其有望用于 PCV2新型快速检测方法的研制。

目录

声明

1 文献综述

1.1 猪圆环病毒的研究进展

1.2 PCV2 引起的 PCVD

1.3 PCV2 检测方法

1.4 PCVD的防制

1.5 单链抗体的研究进展

1.6 噬菌体展示技术

1.7 研究的目的与意义

2 PCV2 Cap 蛋白的表达与纯化

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

4 结论

参考文献

附录

致谢

个人简历