苹果EST-SSR引物的开发及部分品种亲缘关系分析

摘要

苹果属（MalusMill.）植物分布广泛，栽培历史悠久，种质资源极为丰富。苹果属植物基因型高度杂合，种质之间的遗传关系和演化过程等许多理论问题利用传统的分析方法难以解决。开发适用于苹果的EST-SSR标记对于研究苹果属种质资源的起源演化、亲缘关系以及遗传多样性等具有重要意义。本研究利用NCBI数据库中苹果EST的SSR位点，开发了35对EST-SSR引物，建立了苹果EST-SSR体系，并利用筛选出的16对引物对118份苹果资源的亲缘关系进行了研究。研究结果如下： 1.利用SSRIT软件，在NCBI数据库中的86228条单一苹果属EST序列中查找出13259条含SSR的EST，其中有8217条符合可利用性筛选条件。在所有可用的EST-SSR序列中，以二核苷酸为重复单元的序列最多，为4421条，在二核苷酸重复类型中又以CT/TC形式的SSR最为丰富，其次为AG/GA。 2.从筛选出的8217条可利用的EST-SSR序列中随机选取部分序列，依据引物设计原则，利用PrimerPremier5.0软件设计出35对EST-SSR引物。 3.通过对苹果EST-SSR反应体系进行优化，确立了最佳体系。即在25μL体系中，MgCl2浓度为2.0mmol·L-1，dNTPs浓度为0.3mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量为1.0U，DNA模板用量为30ng，引物浓度为0.4μmol·L-1。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。该体系稳定可靠，适用于苹果SSR分析。 4.利用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对35对引物进行筛选，以条带的多态性和稳定性为标准筛选出16对多态性较好的引物。利用这16对引物对118份苹果品种基因组DNA扩增，共扩增出等位基因位点138个，位点数的变化从3到13不等，平均每对引物检测到8.62个位点，总的多态性比率为94.2％，各引物的多态性比例分布于81.8％～100.0％。 5.根据EST-SSR谱带数据统计结果，应用NTSYS-pc2.0e软件进行遗传相似系数计算，118份苹果品种的相似系数的变化范围在0.48～1.00之间，说明供试苹果种质资源间的遗传变异比较大，遗传多样性较高。利用UPGMA法构建聚类树状图，在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为五大组：其中第一组又可分为两个亚组，包含了绝大部分供试材料；第二、三、四和五组包含的品种数目分别为12个、11个、3个和2个；第五组与其它组亲缘关系较远，相似性系数仅为0.48。

目录

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致谢

1 文献综述

1.1 分子标记的概述

1.1.1 RFLP标记

1.1.2 RAPD标记

1.1.3 ISSR标记

1.1.4.AFLP标记

1.1.5 SSR标记

1.1.6 SNP标记

1.2 SSR技术的研究动态

1.2.1 SSR的发现、发生频率及分类

1.2.2 SSR原理、特点与分析程序

1.2.3 SSR引物的开发

1.3 EST概述与EST-SSR技术

1.3.1 EST概述

1.3.2 EST-SSR技术

1.4 EST-SSR技术在果树研究中的应用

1.4.1 EST-SSR的多态性与遗传多样性研究

1.4.2 EST-SSR与遗传连锁图谱的构建

1.4.3 EST-SSR的保守性与物种间的通用性

1.4.4 EST-SSR与物种起源进化

1.4.5 EST-SSR技术的发展前景

2 引言

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 供试仪器试剂

3.2 试验方法

3.2.1 EST-SSR序列的查找

3.2.2 EST-SSR引物对的设计

3.2.3 基因组DNA提取

3.2.4 基因组DNA浓度与纯度检测

3.2.5 SSR-PCR扩增

3.2.6 电泳检测

3.2.7 结果统计与分析方法

4 结果与分析

4.1 EST-SSR序列搜索结果

4.2 基因组DNA的质量和浓度检测

4.3 EST-SSR反应体系的优化

4.3.1 EST-SSR反应体系的初步建立

4.3.2 EST-SSR反应体系的进一步优化

4.3.5 EST-SSR反应体系的验证

4.4 多态性EST-SSR引物的筛选

4.5 EST-SSR扩增产物的多态性分析

4.6 相似性系数与聚类分析

5 结论与讨论

5.1 结论

5.2 讨论

5.2.1 SSR引物的开发

5.2.2 引物筛选的探讨

5.2.3 基因组DNA的提取与保存

5.2.4 对影响EST-SSR技术体系关键因素的探讨

5.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染的探索

5.2.6 条带统计

5.2.7 聚类结果与传统系谱的比较分析

参考文献