抗蚜虫PPA基因高效表达载体构建及其在小麦原生质体中的表达验证

摘要

虫害是威胁农业生产的一个世界性问题，利用转基因技术创造新的抗虫植物品系对农业害虫防治、环境保护及农业可持续发展具有重要意义。目前国内对于植物凝集素抗虫基因转化研究大多集中于雪花莲凝集素(Galanthus nivalis Agglutinin，GNA)基因。天南星科半夏属的掌叶半夏为我国特有的中草药，掌叶半夏块茎的粗提液对蚜虫有强致死作用，粗提液的主要成分是植物凝集素蛋白(Pinellia-pedatisectaagglutinin，PPA)。转半夏凝集素基因的烟草具有比转雪花莲凝集素基因更强的抗桃蚜活性。
　　 在单子叶植物中应用较广的为玉米泛素启动子Ubi，它有着启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等优点，Ubi启动子在转基因小麦中有较高活性，表达效率可达到CaMV35S启动子的4-5倍。绿色荧光蛋白(GFP)是源于海洋生物水母属(Aequorea Victoria)的一种发光蛋白，它作为报告分子有许多优点：稳定、灵敏度高、荧光反应不需要任何底物及辅助因子，使表达检测非常简单，同时它在细胞中自主表达、没有种属特异性、对受体细胞无毒性、对目的基因没有影响。
　　 本试验的目的是将PPA基因连接到植物表达载体pCAMBIA1380上(以Ubi为启动子、GFP为报告基因)，从而构建出一个抗蚜虫的高效植物表达载体，为小麦的遗传转化奠定材料基础，为植物特别是农作物害虫防治提供了新的基因资源。
　　 本文运用基因工程技术对掌叶半夏凝集素PPA基因进行改造，并将其转入真核表达载体，得到以下成果：1、成功构建植物高效表达载体pUGP，该载体包含玉米泛素启动子Ubi、掌叶半夏凝集素PPA基因和绿色荧光蛋白GFP基因，为后续的蛋白表达实验和功能实验提供实验平台和基础材料。2、成功制备小麦原生质体，并对其进行了表达验证。