人脑胶质瘤细胞U251光动力瘤苗的制备及其体外细胞毒性的实验研究

摘要

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，其发病率占全部颅内肿瘤的40％-50％，恶性度高，且呈浸润性生长，手术难以全切除，容易复发；又因中枢神经特有的血脑屏障结构以及脑组织对放射线的耐受性差等特点，所以传统的手术加放疗加化疗的治疗模式往往效果不好，治愈率极低而且并发症较多，术后往往遗留神经功能缺失，如偏瘫、失语，甚至出现思维、情感障碍，尤其是复发率极高。据报道传统的治疗模式，恶性胶质瘤病人的中位生存期不到一年[1]。因此，探索新的治疗方法和治疗模式显得格外重要，而各种脑胶质瘤疫苗尤其是树突状细胞(Dendritic cells DCs)疫苗的出现，使人们看到了曙光。 关于胶质瘤的各种新型的治疗模式层出不穷，近年来关于胶质瘤的综合免疫治疗模式报道较多，尤其是关于胶质瘤的DC疫苗方面，有的已经报道用于临床，效果较好；但胶质瘤的DC疫苗仍然存在许多不足：比如没有特异性好的肿瘤抗原，存在自身免疫性疾病的可能等。 肿瘤的光动力治疗(Photodynamic treatment PDT)以前认为是一种利用肿瘤组织与光敏剂高度亲和性的特点，通过一定波长光激发滞于肿瘤组织的光敏剂，从而产生单态氧，破坏肿瘤细胞或者肿瘤血管，从而达到治疗肿瘤的一种新方法[2]。现在认为PDT治疗肿瘤时不仅仅只是利用单态氧发挥作用，还可以使细胞表面产生一些免疫改变：比如分泌IL-12、TNF-a等细胞因子，同时PDT作用诱发的氧化应激反应也可促进应急蛋白：如HSP70等的表达，然后通过激活核因子kB和AP-1，间接控制多种细胞因子如：IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)、粒集落刺激因子(CSF)、Toll样受体等及其免疫相关基因的表达，从而诱发较强的免疫应答反应[3-6]。本实验利用自体“血清+鸡尾酒法”从正常成人外周血中分离、诱导成熟的DCs作为抗原呈递细胞，将光动力处理过的人脑胶质瘤细胞U251所发生的细胞表面免疫表达以及免疫改变信息获取，从而制备成胶质瘤的光动力疫苗，并通过体外细胞毒实验和普通的冻融疫苗以及热休克疫苗的杀伤效应作比较。 研究目的： 1.制备胶质瘤两种光动力疫苗； 2.在体外证明光动力疫苗的细胞毒效应。 材料与方法： 1.人脑胶质瘤细胞U251对光敏剂HMME(血卟啉单甲醚)的吸收以及排泄特性的研究： 取对数生长的U251与不同浓度的光敏剂HMME分别孵育不同的时间，然后用流式细胞仪检测孵育后细胞的平均荧光强度，间接推测细胞内的光敏剂浓度，了解人脑胶质瘤细胞U251对光敏剂HMME的吸收以及排泄的特性，从而确定U251细胞孵育的光敏剂浓度以及孵育时间，以达到下游实验需要的细胞内光敏剂最佳浓度，并且希望确定细胞内的光敏剂开始排泄的时间，指导临床治疗病人的避光时间。 2.HMME-PDT时不同功率密度对U251的光动力效应的影响： 取已和光敏剂孵育达到最佳细胞内光敏剂浓度的U251细胞用He-Ne连续性激光逐孔照射，调定各组能量密度不同，照射后用MTT法检测各组各孔细胞死亡率，同时设定无激光照射和无光敏剂的空白对照组和单用激光照射和单用光敏剂的阴性对照组，从而确定不同功率密度对光动力效应的影响。 3.人脑胶质瘤细胞U251的培养以及各种抗原的提取和制备： 取足够数目(107以上)对数生长期的U251细胞，分成四组用四种不同的方法制备各种抗原；①组：冻融抗原：冻融法提取全细胞抗原；②组：热休克抗原：利用“热休克法”提取热休克抗原；③组：光动力全细胞抗原：利用上游实验确定好的能量密度的激光照射已和光敏剂孵育过的达到细胞内光敏剂浓度最佳的U251细胞，再用高速离心法提取光动力处理后死细胞的全细胞抗原：④组：光动力细胞表面抗原：用弱酸洗脱法提取光动力处理后活细胞表面的洗脱抗原。 4.“自体血清+鸡尾酒法”分离诱导外周血DCs成熟的研究： 取正常成人外周血约180ml，分成三组分离DCs并诱导其成熟：①：经典脂多糖(Lipopolysaccharid LPS)诱导组：从外周血分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells PBMCs)，用RPMI1640+FBS(胎牛血清)的完全培养基接种于25cm2培养瓶中，两小时后弃悬浮细胞，将贴壁单个核细胞，用GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor)和IL-4(Imerleukin-four)，培养，培养到第6天时加入LPS诱导24小时收集；②：“鸡尾酒”诱导组：单个核细胞的分离及培养同①组，培养到第6天时用细胞因子组合(1000U／ml TNF-α、10ng／ml IL-6、10ng／mlIL-β、1ug／ml PGE2)诱导24小时收集；③：自体血清+“鸡尾酒”诱导组：从外周血分离PBMC后，用RPMI1640+10％自体血清的完全培养基培养，诱导方法同②组。将以上三组分离、诱导的外周血DCs在纯度、成熟度、形态上以及刺激淋巴细胞增殖能力上做比较。 5.DCs的“自体血清+鸡尾酒法”分离培养、诱导成熟以及四种瘤苗的制备： 首先用“自体血清+鸡尾酒法”从外周血分离出足量未成熟DCs，第6天分组诱导成熟，①：冻融抗原负载诱导组：冻融法制备的肿瘤细胞抗原负载联合鸡尾酒法诱导成熟DCs；②：热休克抗原负载诱导组：热休克法制各的肿瘤细胞抗原负载联合鸡尾酒法诱导成熟DCs；③：光动力全细胞抗原负载诱导组：光动力法制备的全细胞抗原负载联合鸡尾酒法诱导成熟DCs；④：光动力洗脱抗原负载诱导组：光动力法制备的沈脱抗原负载联合鸡尾酒法诱导成熟DCs。各组均在诱导24小时后收获DCs用于下游细胞毒实验。 6.淋巴细胞的分离、培养和筛选以及各种瘤苗诱导特异性CTL细胞毒实验： 参照文献报道用尼龙毛柱分选法分选外周血分离的非贴壁的单核细胞(主要是淋巴细胞)，分选后的淋巴细胞于24孔板用添加了100U／ml IL-2的RPMI 1640完全培养基培养，用于下游实验；将上游实验各组制备的成熟的经过抗原负载的DCs 2×105／ml与分选过的淋巴细胞(主要为T淋巴细胞)共培养5天，成为免疫效应细胞；然后再和靶细胞U251共培养24小时，用MTT法检测靶细胞的存活率，从而比较各组瘤苗的体外细胞毒效应。实验 结果： 1.人脑胶质瘤细胞U251对光敏剂HMME(血卟啉单甲醚)的吸收、代谢以及排出特性：流式细胞仪测定结果表明：当光敏剂浓度恒定为40ug／ml时，随着孵育时间的增加，细胞内光敏剂浓度总体趋势是增加的，但到了36小时后总体趋势是下降的，说明细胞内光敏剂已经开始排泄，并且2小时内增加趋势明显，2小时后增加趋势明显变缓，各组差别无统计学意义；当孵育时间恒定为2小时，随着的光敏剂浓度增加，细胞内光敏剂浓度总体趋势是增加的，并且在增加到40ug／ml前趋势明显，之后明显变缓。 2.HMME-PDT时不同功率密度对U251的光动力效应的影响： 在光敏剂浓度和孵育时间恒定的情况下，随着功率密度的增加，U251细胞的存活率明显下降；当功率密度达到2.4J／cm2时，死亡率几乎为50％，当功率密度达到7.2J／cm2时，死亡率几乎为100％；单用激光对U251的死亡率没有影响，单用光敏剂，在光敏剂浓度不超过40ug／ml时，对U251细胞没有毒性作用。 3.“自体血清+鸡尾酒法”诱导外周血DCs的成熟度、纯度以及刺激淋巴细胞增殖能力分析：“自体血清+鸡尾酒法”诱导的DC成熟过程中形态好、突起多；成熟表型CD80、CD86、CD83以及HLA-DR的平均表达率分别是88.60％、50.55％、73.89％、93.24％，明显高于其它两组，提示自体血清+“鸡尾酒法”诱导组的DC细胞纯度及成熟度均最高；激活淋巴细胞增殖指数为2.03，明显高于其它两组。 4.四组瘤苗的体外对靶细胞的细胞毒效应比较结果： 通过MTT检测结果表明：四组瘤苗的体外对靶细胞的细胞毒效应大小分别是洗脱组>全细胞抗原组>热休克抗原组>冻融抗原组。 结论： 1.人脑胶质瘤细胞U251对光敏剂HMME的吸收量是与孵育时间(≦2h)和光敏剂浓度(≦40ug／ml)成正相关。 2.在一定条件下，PDT效应与能量密度成正相关；单用激光对细胞无杀伤性，单用光敏剂在浓度不超过40ug／ml时，对细胞无毒性。 3.“自体血清+鸡尾酒法”诱导外周血DCs是一种很好的(简单、方便、经济)外周血DC分离诱导成熟的新方法。 4.光动力瘤苗较目前传统瘤苗在体外具有更强的细胞毒效应。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章研究目的

第三章材料与方法

第四章实验结果

第五章讨论

第六章结论

第七章展望

参考文献

综述 脑胶质瘤疫苗的研究现状和进展

附录

附图

致谢