多发性硬化及视神经脊髓炎的遗传学与免疫学特点以及轴突损害评估与保护的研究

摘要

目的： 1.探索AQP4启动子区基因的多态性，并探讨其与我国多发性硬化(MS)及视神经脊髓炎(NMO)患者遗传易感性的关系，从遗传学角度对MS及NMO进行鉴别。 2.研究MS及NMO患者血清和脑脊液VEGF水平及脑脊液αB晶状体蛋白的差异，并探讨其与临床、实验室及影像学指标的关系，从免疫学角度对MS与NMO进行鉴别。 3.研究MS、NMO及临床孤立综合征(CIS)患者脑脊液sAPP、Aβ42水平的差异，及其与临床、实验室及影像学指标的关系，探讨APP对MS、NMO轴突损害评估及早期推测病情预后的作用。 4.研究MS、NMO及CIS患者血清及脑脊液BDNF、GDNF水平的差异，及其与临床、实验室及影像学指标的关系，探讨BDNF、GDNF对MS、NMO的神经保护作用。 方法：对124例符合入选标准的MS、NMO及CIS患者及78例对照组进行研究，其中MS患者分为OSMS及CMS两组。对所有MS、NMO及CIS患者复发期及缓解期进行EDSS评分，对95例MS、NMO及CIS患者进行头颅、脊髓及视神经MRI检查，5例MS患者进行了MRS及DTI检查，对109例MS、NMO及CIS患者进行了血清及脑脊液寡克隆带定量、定性测定。用酚/氯仿抽提法从患者及健康对照组全血标本中提取DNA，PCR扩增AQP4启动子区基因(AQP4-Promoter0和AQP4-Promoter1基因)，再对PCR产物进行纯化、测序，通过与GenBank公布的人类AQP4基因序列比较，寻找阳性突变位点。应用Western-blot法检测患者及对照组脑脊液中的sAPP及αB晶状体蛋白；用液相芯片分析技术检测血清及脑脊液BDNF、GDNF、VEGF、Aβ42浓度；用ELISA法检测脑脊液αsAPP浓度。 结果： 1.成功扩增并测定了80例患者(其中NMO8例、MS47例、CIS25例)和39例对照组的AQP4启动子区基因序列，共发现14个AQP4-promoter0阳性突变位点及6个AQP4-promoter1阳性突变位点。其中，MS患者AQP4-promoter0的-1003bp位点突变率(A突变为G)比对照组高，差异有统计学意义(P=0.016)；NMO及MS患者AQP4-promoter1的—401bp与—400bp位点之间的突变率(插入1个C)均比对照组高，差异有统计学意义(P=0.027和0.01)。 2.有AQP4启动子区基因突变的MS患者出现MRI下丘脑病灶的概率比无基因突变的MS患者高，差异有统计学意义(P=0.047)。 3.NMO、MS及CIS患者发作期脑脊液VEGF平均荧光强度比对照组高，差异有统计学意义(P=0.015、0.016及0.02)，但NMO与MS、CMS与OSMS患者之间无显著性差异(P>0.05)。 4.BBB指数升高组及Tourtellotte合成率升高组NMO及MS患者血清VEGF浓度比上述指标正常组高，差异有统计学意义(P=0.0037及0.021)。 5.Western—Blot结果显示，NMO、MS、CIS患者及对照组脑脊液中均可检测到分子量为110Kda及22Kda(分别与sAPP及αB晶状体蛋白分子量相同)的条带，各组条带的灰度强弱无明显差异。 6.NMO、MS、CIS和对照组脑脊液αsAPP与Aβ42浓度呈正相关关系(Spearman相关系数为0.37，P=0.011，Kendall's tua—b相关系数为0.265，P=0.009)，脑脊液αsAPP浓度与EDSS评分呈负相关关系(Spearman相关系数为—0.371，P=0.004；Kendall's tua—b相关系数为—0.258，P=0.007)，EDSS≥4.5分组患者脑脊液αsAPP浓度比EDSS<4.5分组低，差异有统计学意义(P=0.026)。 7.他汀类药物治疗组患者脑脊液αsAPP水平比无使用该药治疗组患者高，差异有统计学意义(P=0.023)。 8.MS患者脑脊液BDNF浓度比对照组高，差异有统计学意义(P=0.046)；血清与脑脊液BDNF浓度不相关(Pearson相关系数为—0.255，P=0.091)。 9.脑脊液BDNF与GDNF浓度呈正相关关系(Spearman相关系数为0.624，P<0.01；Kendall's tua—b相关系数为0.494，P<0.01)。 10.血清GDNF浓度与EDSS评分呈正相关(Spearman相关系数为0.303，P=0.025；Kendall's tua—b相关系数为0.203，P=0.038)，EDSS≥4.5分的患者血清GDNF浓度比EDSS<4.5分的患者高，差异有统计学意义(P=0.045)。 11.脑脊液BDNF、GDNF均与Aβ42呈正相关(Spearman相关系数分别为0.251及0.420，P<0.05；Kendall's tua—b相关系数分别为0.179及0.308，P<0.05)。 12.10名有MRI结果的NMO患者中，有4名(40％)发现有脑部MRI病灶，均为非特异的皮质下白质改变；5名行MRS检查的MS患者均显示病灶区NAA含量下降，且与脑脊液αsAPP水平升高相关。 结论： 1.成功完成了AQP4启动子区基因的扩增及DNA序列测定，发现了14个AQP4-promoter0阳性突变位点及6个AQP4-promoter1阳性突变位点。其中，AQP4-promoter0中-1003bp位点的突变(A突变为G)以及AQP4-promorter1中—401bp与—400bp位点之间的突变(插入1个C)与MS、NMO易感性有关。AQP4启动子区基因突变与MS患者MRI下丘脑病灶可能有一定的关系。 2.NMO、MS患者发作期脑脊液VEGF水平比对照组高，但与临床分型无关。血清VEGF浓度与MS病灶中BBB破坏的形成及CNS内IgG合成有关。 3.sAPP及αB晶状体蛋白在NMO、MS、CIS患者及对照组脑脊液中均存在，各组含量未见明显差异。 4.脑脊液αsAPP水平与NMO、MS患者神经功能残疾及MRS中NAA含量下降相关。脑脊液αsAPP及Aβ42浓度呈正相关，二者可能均可用于MS轴突损伤的评估。他汀类药物可能通过提高脑脊液αsAPP水平对NMO及MS患者具有神经保护作用。 5.MS患者脑脊液BDNF浓度比对照组高，可能是CNS损伤后机体的一种代偿机制。血清与脑脊液BDNF浓度不相关，提示二者来源可能不同。MS、NMO患者脑脊液BDNF与GDNF水平呈正相关关系，二者对神经保护可能具有协同作用。血清及脑脊液BDNF、GDNF水平与NMO、MS患者神经功能残疾及轴突损伤相关。 6.NMO患者也可出现脑部MRI异常，且多为非特异的皮质下白质改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词表

声明

前言

材料与方法

第一节 病例收集及标本采集

第二节 临床评分、影像学及寡克隆带检查

第三节 AQP4启动子区基因多态性分析

第四节 血清及脑脊液免疫学指标检测

第五节 统计学分析

结果

第一部分 核磁共振检查及寡克隆带测定结果

第二部分 MS与NMO的鉴别

第一节 遗传学鉴别(AQP4启动子区基因扩增及测序结果)1

第一节 遗传学鉴别(AQP4启动子区基因扩增及测序结果)2

第一节 遗传学鉴别(AQP4启动子区基因扩增及测序结果)3

第二节 免疫学鉴别(VEGF及αB晶状体蛋白检测结果)

第三部分 MS及NMO的轴突损害评估及神经保护

第一节 轴突损害指标(sAPP及Aβ42)检测结果

第二节 神经营养因子(BDNF及GDNF)检测结果

讨论

第一部分 MS与NMO的鉴别

第二部分 MS与NMO的轴突损害评估及神经保护

第三部分 MS与NMO的MRI特点

结论

参考文献

致谢