源嗜水气单胞菌致病性和疫苗的研究

摘要

大黄鱼是具有很高经济价值的海洋鱼类,产于我国南方。与其相关的细菌病害如弧菌病,爱德华氏病,败血病等已经报道,但气单胞菌感染的报道鲜见。从患败血病的大黄鱼体内不同组织分离出5株菌,分两个类型:嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌。它们的生物学特性本文已描述。被感染的鱼出现食欲下降或停止进食、游动迟缓、水面浮游等症状。检查濒死和死亡不久的鱼体发现腹部有微小出血斑,背鳍根部肌肉溃烂,肛门肿大,肝脏贫血等病灶。人工感染表明这些症状系气单胞菌属的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)所致。随着大黄鱼养殖规模不断扩大,此二菌引起的病害应得到足够的重视。
　　培养分离菌后再进行人工感染试验分析该二菌的毒性。两种分离菌经普通NB与改良NB培养后,将它们胞外物产物(ECPs)组合成三种注射物(A. hydrophila&A. caviae;A. hydrophila;A. caviae),分别注射到分组后的大黄鱼和鲻鱼体内,观察五天,计算累积死亡率。用t-test检验分析不同组之间死亡差异性。大黄鱼死亡率的t-test检验结果显示:嗜水气单胞菌与豚鼠气单胞菌混菌致病力显著强于它们单菌注射(P<0.000001 for A. hydrophila or P<0.005 for A. caviae);嗜水气单胞菌显著(P<0.005)强于豚鼠气单胞菌;改良NB培养的二者ECPs混合物致死率显著(P<0.05)高于豚鼠气单胞菌ECPs;嗜水气单胞菌ECPs致死率显著(P<0.0005 for mNB, P<0.05 for NB)高于豚鼠气单胞菌ECPs;ECPs注射试验中改良NB与普通NB之间死亡率无显著差异;活菌混合物致死力显著强于ECPs(P<0.05 for mNB,P<0.005 for NB)混合物的致死力;嗜水气单胞菌活菌致死力显著高于其ECPs致死力(P<0.05 for mNB or NB);豚鼠气单胞菌与其ECPs致死力无显著(P>0.05)差异性。鲻鱼t-test检验结果与大黄鱼类似,但是有两点明显不同于大黄鱼。第一,改良NB培养的嗜水气单胞菌ECPs致死力显著(P>0.05)强于普通NB;第二,嗜水气单胞菌活菌与改良NB培养的嗜水气单胞菌ECPs的致死力无显著(P>0.05)差异。
　　人工感染证明这两种菌都可使大黄鱼和鲻鱼致死,但是嗜水气单胞菌的毒性更强,而两种活菌混合物的致死率高于嗜水气单胞菌单独感染,甚至高于两种菌单独感染致死率的总合。如在菌浓度为106 cfu/ml下,注射活菌混合物时大黄鱼死亡率为71.4,而嗜水气单胞菌与豚鼠气单胞菌单独感染致死率的总合仅有42.9％。另一方面,从t-test检验结果也可以看出A. hydrophila&A. caviae协同作用提高大黄鱼死亡率,这暗示着嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌在宿主体内环境下存在某种机制而提高了二者整体的致病力。T-test检验结果还显示对于鲻鱼来说,改良NB培养的嗜水气单胞菌ECPs比普通NB培养的毒性更强,说明改良NB更有助于嗜水气单胞菌胞外毒素的分泌。我们还可以看见对于鲻鱼来说嗜水气单胞菌活菌感染与改良NB培养的嗜水气单胞菌的ECPs致死率无显著差异,说明改良NB的培养条件比普通NB更接近宿主体内环境。
　　运用不同的方法制备疫苗,包括福尔马林灭活疫苗(FKC)和超声灭活疫苗(UKC)。在超声灭活疫苗制备过程中,各组菌悬液中添加了不同的辅助剂,分别为PEG6000+EDTA、PEG200+EDTA、DMSO+EDTA、EDTA。结果发现 PEG6000+EDTA超声灭活时间短、灭活彻底、疫苗富集效果好,将该辅助剂作为重点研究。五种疫苗(4种UKC和1种FKC)对锦鲤腹腔免疫后,测得PEG6000超声灭活疫苗可以最有效的促进锦鲤免疫指标的提高,且对锦鲤免疫保护力最高。为了使疫苗抗原天然性得到保护和协助疫苗更有效的刺激鱼体免疫系统发生应答,我们经过多次重复试验探索 PEG6000最佳浓度,结果表明25%的PEG6000可以得到最佳效果。

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第一章 前 言

1.1 病原菌的致病机制和宿主的防御系统

1.1.1 病原菌的致病“利器”—毒力因子

1.1.2宿主的防御“护盾”—免疫系统

1.2 鱼用疫苗

1.2.1 疫苗种类和制备

1.2.2 疫苗的接种途径

1.2.3 我国鱼用疫苗的前景和存在的问题

第二章 气单胞菌的鉴定与毒性试验

2.1材料与方法

2.1.1.试剂仪器

2.1.2 材料

2.1.3病原菌分离

2.1.4菌种鉴定

2.1.6感染和毒性试验

2.1.7 累计死亡率差异性分析

2.2 结果与分析

2.2.1 菌种鉴定

2.2.2 药敏试验

2.2.3 人工感染和毒性试验

2.2.4 累计死亡率差异性

2.3 讨论

第三章 嗜水气单胞菌疫苗的研究

3.1材料和方法

3.1.1试验材料

3.1.2 试验方法

3.2 试验结果

3.2.1 福尔马林最小杀菌浓度试验

3.2.2 PEG浓度优化实验

3.2.3 超声灭活试验

3.2.4 上清液蛋白含量

3.2.5 灭活疫苗安全性试验

3.3讨论

第四章 嗜水气单胞菌疫苗免疫效果的研究

4.1 材料与方法

4.1.1试验菌株

4.1.2 试验用鱼

4.1.3 疫苗的制备

4.1.4 疫苗的无菌检验及安全性检验

4.1.5 疫苗接种及二次免疫

4.1.6 采血

4.1.7 免疫指标的测定

4.2 实验结果

4.2.1 疫苗的无菌检验及安全性检验

4.2.2血清对嗜水气单胞菌的杀菌活力

4.2.3血细胞吞噬活力

4.2.4 抗菌活力

4.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活力

4.2.6 血清蛋白含量

4.2.7 抗体效价的测定

4.2.8 攻毒试验

4.3 讨论

结束语

参考文献

致谢