灯盏花素对腹膜透析效能以及腹膜间皮细胞TLR4信号传导影响的实验研究

摘要

本研究分为三部分： 第一部分：自制腹透管尿毒症大鼠腹膜透析模型的建立 目的： 建立腺嘌呤尿毒症大鼠模型，在此基础上研究自制腹透管和手术方式建立尿毒症大鼠腹膜透析模型。 方法： SD大鼠用含有7500mg·kg-1腺嘌呤的颗粒饲料喂养，投放量为300mg/(kg·d)，连续喂养7w，检测血清尿素氮、肌酐和肾脏病理确定尿毒症鼠模型的建立是否成功。 结果： 1、腹透管完整性比较：自制1组、传统头皮针组大鼠腹透管完好，无管道破损和渗漏 2、出口处和隧道口感染情况：自制1组3例，自制2组2例，传统头皮针组6例发生隧道口感染。 3、腹膜炎发生情况：自制1组1例，自制2组7例，传统头皮针组3例发生腹膜炎。 4、腹透液排出情况：自制1组第1天与第15天相比腹膜透析出液量无统计学差异 5、15天后自制1组腹膜透析管腹腔端被大网膜完全包裹1例、部分包裹5例，传统头皮针组完全包裹4例、部分包裹6例。 结论： 1、采用自制硅胶吸痰管作为腹透管，外口使用一次性无菌输液接头连接，腹透管出口由后背颈部皮肤穿出的手术方式构建的尿毒症大鼠腹膜透析模型，具有成功率高的特点。 2、正确的手术方式，是模型建立的基本保证，而透析管道的选材、接头稳固耐用是腹膜透析模型能否长期使用的关键。 第二部分：体内实验 实验一、灯盏花素对尿毒症大鼠腹膜透析效能以及腹膜结构的影响 目的： 观察灯盏花素对尿毒症大鼠腹膜透析效能以及腹膜结构的影响。 方法： 将采用含腺嘌呤喂养制作尿毒症模型，随后采用自制腹透管行腹膜透析置管术制作腹膜透析模型，使用LPS加入腹腔建立尿毒症大鼠腹膜透析UFF模型。 结果： 1.腹膜效能及腹膜超滤量的影响： 2.大鼠腹膜组织病理变化： 结论：灯盏花素具有防止腹膜间皮细胞损伤，维持腹膜结构的完整性，改善局部微循环，提高腹膜的超滤效能等作用。以高、中浓度灯盏花素组为好。 实验二、灯盏花素对大鼠腹膜间皮细胞TLR4基因表达及信号通路的影响 目的： 探讨TLR4及其信号通路在腹膜失超滤中所起的作用，并且观察灯盏花素对其干预作用。 方法： 取实验一各组大鼠腹膜，免疫组化方法检测腹膜组织TLR4蛋白表达；采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4mRNA的表达情况；ELISA方法检测腹透液中MCP-1、MIP-2的浓度变化。 结果： 1.腹膜组织TLR4mRNA的表达： 2.组织细胞TLR4蛋白的免疫组织化学的表达： 3.腹透液MCP-1、MIP-2浓度的变化(ELISA)： 结论： 1.腹膜透析腹膜组织TLR4的表达量与腹透液中MCP-1、MIP-2浓度呈正相关，并与腹膜问皮细胞受损程度正相关。 2.灯盏花素对于TLR4的表达，以及由于TLR4激活所产生的MCP-1、MIP-2炎症因子具有下调效应。 第三部分：体外实验 实验一、灯盏花素对腹膜间皮细胞生长和增殖的影响 目的： 本研究旨在通过观察体外培养时灯盏花素对大鼠腹膜间皮细胞生长和增殖的影响，探讨间皮细胞受损的机制。 方法： 对SD大鼠腹膜间皮细胞进行分离培养，间皮细胞分成8组，分别加入灯盏花素和LPS，包括：单纯培养基组(1组)、50ul灯盏花素组(2组)、25ul灯盏花素组(3组)、12.5ul灯盏花素组(4组)、50ul灯盏花素+10ulLPS组(5组)、25ul灯盏花素+10ulLPS组(6组)、12.5ul灯盏花素+10ulLPS组(7组)、10ulLPS组(8组)。培养48小时和72小时后通过细胞计数了解间皮细胞生长情况；培养72小时后加入MTT5mg/孔，用酶标仪490nm比色，了解间皮细胞增殖情况。 统计学方法：数据以均数士标准差(x±s)表示。应用SPSS13.0统计软件，单因素组间比较采用OneWayANOVE、SNK检验，多组间比较采用重复检验方差分析。 结果： 1.细胞数量影响：间皮细胞培养48小时和72小时后进行计数组间存在显著性差异(F=182.738，P=0.000；F=677.589，P=0.000)，各个加药组间也存在显著性差异(F=606.988，P=0.000)。在未加LPS组中，3组(中等剂量)和4组(低剂量灯盏花素组)间皮细胞生长良好，与1组(对照组)相比无显著性差异(P=0.086，1.000)；2组(高浓度组)与1组相比具有显著性差异(P=0.004)。而加LPS组间皮细胞生长情况差于未加组，在LPS组中，加入5组(灯盏花素高浓度组)、6组(中浓度组)和7组(低浓度组)对LPS对间皮细胞生长抑制作用具有拮抗作用(P=0.000)。 2.细胞增殖的影响：加药组间具有统计学差异(F=1265.008，P=0.000)。未加LPS组中1、3、4组的间皮细胞增殖无显著差异(P=0.64，0.929)，2组的间皮细胞增殖与3、4组比较无显著性差异(P=0.705)，与1组比较存在显著性差异(P=0.039)。加有LPS组中5、6组间无统计学差异(P=0.771)，其余各组间存在统计学差异(P=0.000)，其中8组间皮细胞增殖最差，7组次之。 结论： 1.灯盏花素对于间皮细胞的生长和增殖具有保护作用。 2.灯盏花素能够减轻LPS引起的免疫炎症造成的间皮细胞的损伤，且存在量效正相关关系。 实验二、灯盏花素对腹膜间皮细胞TLR4表达及信号通路的影响 目的： 观察体外腹膜间皮细胞TLR4以及信号通路的表达情况，研究灯盏花素对TLR4的信号通路以及相关信号因子影响的分子机制。 方法： 体外进行间皮细胞培养，分组同体外实验一，给予灯盏花素和LPS进行干预，72小时后采用RT-PCR法对间皮细胞TLR4mRNA表达进行检测；采用ELISA方法对培养上清液MCP-1、MIP-2浓度进行检测。 统计学方法：数据以均数士标准差(x±s)表示。应用SPSS13.0统计软件，多组间比较采用OneWayANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者多组间多重比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验。检验水平a=0.05。 结果： 1.间皮细胞培养上清中MCP-1，MIP-2的浓度变化：MCP-1、MIP-2的浓度在不同组间存在显著性差异(F=80.358，P=0.000；F=320.101，P=0.000)。未加LPS组间(1～4组)MCP-1、MIP-2浓度无统计学差异(P>0.05)，加有LPS的4组中，高浓度灯盏花素组(5组)、中浓度灯盏花素组(6组)与单纯LPS组(8组)间存在统计学差异(P<0.01)，而低浓度灯盏花素组(7组)与8组间无统计学差异(P>0.05)。 2.间皮细胞TLR4mRNA表达检测：在未加LPS的1～4组中间皮细胞TLR4mRNA的表达量相当，无统计学差异(x2=2.544，v=3，P=0.467)；在加有LPS的5～8组中间皮细胞TLRmRNA的表达量存在的差异有显著性意义(x2=25.63，v=3，P=0.000)，8组(未加灯盏花素组)和7组(低浓度灯盏花素组)表达量相对高，平均秩次分别27.28、27.50，而5组(高浓度灯盏花素组)和6组(中浓度灯盏花素组)表达量低，平均秩次分别为9.56、9.67，可以认为不同浓度灯盏花素对TLR4mRNA的表达量的影响不同。 结论： 1.MCP-1、MIP-2对于TLR4具有依赖性，证明了TLR4信号通路的存在的。 2.灯盏花素具有下调腹膜间皮细胞TLR4mRNA及信号通路表达的作用。 全文结论：本研究通过在尿毒症大鼠腹膜透析模型基础上进一步建立尿毒症大鼠腹膜透析UFF模型以及间皮细胞培养的实验研究，证明TLR4及其信号传导在腹膜透析腹膜发生纤维化(即腹膜超滤失败)所发挥的作用。而灯盏花素具有提高腹膜透析效能和保护腹膜间皮细胞的作用，其作用机理与下调TLR4表达，降低MCP-1、MIP-2的含量有关，为其临床推广应用于治疗腹膜透析失超滤提供了较为全面、深入的分子水平的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

第二章自制腹透管尿毒症大鼠腹膜透析模型的建立

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三章体内实验

实验一、灯盏花素对尿毒症大鼠腹膜透析效能以及腹膜结构的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

实验二、灯盏花素对大鼠腹膜TLR4表达及信号通路的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第四章体外实验

实验一、灯盏花素对腹膜间皮细胞生长和增殖的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

实验二、灯盏花素对腹膜间皮细胞TLR4表达及MCP-1、MIP-2浓度的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第五章全文小结

第六章附录

照片

综述 Toll样受体与肾脏疾病关系的研究进展

缩写词中英文对照表

研究生毕业论文统计学审稿证明

第八章攻读学位期间成果

第九章致谢