黄芪多糖联合丁酸钠对K562细胞红系分化及珠蛋白基因表达作用的研究

摘要

背景与目的：
　　 β-地中海贫血(β-thalassemia，β-地贫)是一种常见的单基因遗传病，是由于β-珠蛋白基因突变或缺失，使β-珠蛋白链合成障碍，导致相对过剩的α-肽链形成包涵体沉积于细胞膜上，引起红细胞变形能力下降，在脾脏内被大量破坏所致的一组遗传性溶血性疾病。我国南方发病率较高，在造血干细胞移植尚难于广泛推广的情况下，药物诱导基因治疗已是临床医生及生物学家共同关注，致力研究的另一种方法。应用药物调控珠蛋白基因表达的遗传开关，激活非α珠蛋白基因的功能，增加非α珠蛋白的合成速率，或抑制α珠蛋白基因功能，降低α珠蛋白的合成速率，从而减轻α和非α珠蛋白的失平衡程度，甚至恢复α和β珠蛋白两者比例的平衡，达到减轻临床症状的目的。
　　 目前人们多致力于γ珠蛋白基因诱导剂的研究，它可以重新激活红系细胞中已基本关闭的γ珠蛋白基因，合成γ链以替代缺陷的β珠蛋白链与相对过剩的α链构成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)，降低α链与非α链之间的不平衡。有研究发现部分γ珠蛋白基因诱导剂也能调节α、ξ、β、ε、δ珠蛋白基因表达，并影响α链与非α链的平衡。
　　 1982年国外首次报告应用5-氮杂孢苷(5-azacytidine，5-AZAC)治疗β-地贫取得较好疗效，但其作用维持时间短，不良反应大，有远期致癌性，限制了其在临床的进一步使用；随后发现的羟基脲(Hydroxyurea，HU)在治疗镰状细胞贫血方面效果甚佳，但治疗β-地贫时至少有25％的患者无效，且长期应用易引发骨髓抑制；而丁酸钠(Sodium butyrate，NaB)，虽然毒副作用较小，但其半衰期短，使用不便且费用昂贵，诸多因素使这些药物的临床应用受到一定限制；自八十年代至今二十年来已陆续有七十几种药物通过体内外实验证明是有效的γ珠蛋白基因诱导剂，由于部分诱导剂特异性差、毒性强等原因，进入临床使用的只有少数几种，且只有HU通过美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准。因此迫切需要更有效安全的新药开发及新的治疗策略来解决这些问题。新的化合药物开发花费大且耗时长，而具有中国传统特色的天然中药不良反应轻微，药源丰富，价格合适，具有良好的研究开发前景，已有研究发现当归根素、白藜芦醇等天然提取物能有效上调γ珠蛋白基因表达，但尚未用于临床。在新药开发的同时，联合用药治疗成为研究的另一方向，联合药物不同作用机制及靶点协同上调γ珠蛋白基因表达，并降低用药剂量减轻细胞毒性成为治疗的关键；已有较多学者对HU与NaB、HU与EPO等联合用药进行研究，证明联合用药能协同诱导HbF生成，但由于实验对象、基因型、用药剂量、样本量等多方面因素导致部分研究结果不一致，故临床仍无统一治疗标准。目前临床常用γ基因诱导剂多为细胞毒类药，药物联合虽然可降低用药剂量减轻细胞毒性，但β-地贫的治疗是一个长期的终生治疗，其远期疗效及毒副作用尚不确切，需继续深入研究，寻找发现更有效、安全的治疗方案。
　　 本课题组长期从事药物诱导γ珠蛋白基因表达方面的研究，多致力于中药类开发，并于05年首次发现黄芪可诱导K562细胞向红系分化，并且增加γ珠蛋白基因表达和HbF合成；并进一步研究证明APS是黄芪诱导K562细胞向红系分化的有效成份，虽然其联苯胺染色阳性率低于NaB单药常规剂量，但由于药物毒性低，联苯胺染色阳性细胞总数却明显高于NaB，且作用持续时间长，是一种有效的γ基因诱导剂，但其对其他珠蛋白基因的表达作用尚未明确。研究表明黄芪中最重要的天然有效成分黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)，具有刺激造血的作用，可以提高红系集落形成单位(colony-forming unit-erythroid，CFU-E)和红系爆式集落形成单位(burst formingunits-erythroid，BFU-E)的形成率，从而增加红细胞数量与血红蛋白量，并对放化疗后所致骨髓造血功能的破坏有明显的保护作用。结合APS作用持续长、低毒及骨髓保护等作用，将其与半衰期短、口服剂量大的细胞毒类诱导剂NaB联合可能是新的选择，能更有效诱导红系分化，调节γ及其他珠蛋白基因表达，减少用药剂量，减轻细胞毒性。
　　 本研究旨在探讨黄芪多糖联合丁酸钠对K562细胞红系分化及七种珠蛋白基因表达的诱导作用。以具有向红系分化能力的人红白血病细胞系K562细胞为模型，首先通过台盼蓝拒染活细胞计数实验检测药物对细胞的生长抑制率(inhibition rate)，及联苯胺染色实验观察药物诱导细胞红系分化后联苯胺染色阳性率(Benzidine positive cells，BZ％)，选择对细胞生长抑制及红系分化作用优于NaB常规剂量组的最佳用药剂量组合，然后用RT-PCR探讨该组合对七种珠蛋白基因表达的作用。研究结果将为诱导γ珠蛋白基因表达的联合用药研究增添新的科学数据和研究思路，为临床联合用药方案及实施提供理论依据。
　　 方法：
　　 1黄芪多糖联合丁酸钠作用K562细胞最佳浓度的选择1.1不同浓度黄芪多糖、丁酸钠分别对K562细胞生长抑制及红系分化的影响1.1.1实验分组：实验分为2组，分别为黄芪多糖单药组(0～20mg/ml)；丁酸钠单药组(0～1000μmol/L)。
　　 1.1.2台盼蓝拒染活细胞计数实验：观察药物对细胞生长抑制的影响。细胞生长抑制率计算公式为：[(Cn-C0)-(Tn-T0)]/(Cn-C0)×100。C和T分别代表对照组和实验组每毫升细胞数，n和0为计数时的天数1.1.3联苯胺染色实验：观察药物诱导K562红系分化的程度。计数500个细胞中联苯胺阳性细胞数，联苯胺阳性细胞百分率=联苯胺阳性细胞数/500×100％。
　　 1.2选择联合用药最佳浓度1.2.1联合用药组浓度选择标准：根据单个药物抑制率、半数抑制浓度(IC50)及联苯胺染色结果，选择能诱导细胞红系分化，IC50值上下的不同浓度联合。
　　 1.2.2筛选最佳联合用药剂量：①观察联合用药96小时细胞生长抑制率。q值判断黄芪多糖与丁酸钠联合对细胞生长抑制的作用。q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，式中EA和EB为各药单用抑制率，EAB为两药合用抑制率。q>1.15为协同作用，0.85≤q≤1.15为相加作用，q<0.85为拮抗作用。
　　 ②联合用药诱导K562细胞96小时联苯胺染色阳性率。
　　 2黄芪多糖、丁酸钠单药及联合用药对K562细胞红系分化及珠蛋白基因表达的作用2.1实验分组：实验分为5组，APS2.5mg/ml+NaB250μmol/L为实验组，APS2.5mg/ml、NaB250μmol/L为单药低剂量组，NaB500μmol/L为常规剂量组，K562亲本细胞为未用药组。
　　 2.2联苯胺染色观察细胞红系分化程度。
　　 2.3 RT-PCR分析APS与NaB联合作用K562细胞对珠蛋白基因表达的影响。
　　 3统计学方法
　　 采用SPSS13.0统计软件进行分析。以上实验均重复三次，实验数据采用均数±标准差表示，细胞生长抑制率、联苯胺染色阳性率、各用药组珠蛋白mRNA/未用药组mRNA灰度比值比较采用析因分析；多组间均数比较采用One-way ANOVA，post hoc test方差齐性采用LSD法，方差不齐的采用DunnettT3法；P<0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 1黄芪多糖联合丁酸钠作用K562细胞的最佳浓度1.1台盼蓝拒染活细胞计数结果表明：不同浓度APS、NaB对K562细胞生长均存在不同程度的抑制作用，抑制率随着药物浓度的降低而减轻，具有剂量依赖关系；随着时间的延长而增加，具有时间依赖关系。
　　 1.2联苯胺染色结果显示：不同浓度APS、NaB作用于K562细胞均能诱导红系分化，其程度具有剂量时间相关性。
　　 1.3依据台盼蓝拒染活细胞计数及联苯胺染色结果分析发现：APS与NaB联合最佳组合有APS2.5mg+NaB100μM与APS2.5mg+NaB250μM两组，其作用K562细胞96小时后联苯胺染色细胞阳性率(BZ％)、细胞生长抑制率及细胞活力分别为(18.88±1.98)％、(46.24±2.97)％、(93±1.6)％和(35.59±2.23)％、(67.47±3.76)％、(90±1.2)％，与单药常规剂量组NaB500μM(16.27±1.09)％、(88.86±1.53)％、(74±2.4)％比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 2黄芪多糖、丁酸钠单药及联合用药对K562细胞红系分化及珠蛋白基因表达的作用2.1黄芪多糖、丁酸钠单药及联合用药对K562细胞红系分化的作用联苯胺染色结果显示APS2.5mg、NaB250μM联合用药可诱导K562细胞向红系分化，于48-144小时BZ％增高显著，96小时达高峰BZ％为(32.89±0.24)％、，与常规剂量组NaB500μM(14.66±0.17)％比较增高有显著意义(P<0.05)；与单药低剂量组APS2.5mg(7.72±0.12)％、NaB250μM(7.58±1.46)％比较均增高有显著性意义(P<0.05)。
　　 2.2黄芪多糖、丁酸钠单药及联合用药对K562细胞珠蛋白基因表达的作用RT-PCR结果显示，APS+NaB能使γ珠蛋白基因表达上调，Gγ、Aγ-mRNA表达上调分别为2.40±0.02倍、1.61±0.01倍，与常规剂量组NaB500μM(2.08±0.02倍)、(1.31±0.02倍)比较有显著性差异(P<0.05)；与单药低剂量组APS2.5mg(1.25±0.01倍)、(1.19±0.02倍)、NaB250μM(1.26±0.01倍)、(1.18±0.01倍)比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 α-mRNA表达上调1.16±0.02倍，与NaB500μM(1.14±0.02倍)比较无显著性差异(P>0.05)；与APS2.5mg(1.07±0.04倍)、NaB250μM(1.02±0.13倍)比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 β-mRNA表达上调1.73±0.03倍，与NaB500μM(1.25±0.03倍)比较有显著性差异(P<0.05)；与APS2.5mg(1.11±0.01倍)NaB250μM(1.16±0.02倍)比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 ε-mRNA表达上调1.40±0.04倍，与NaB500μM(1.53±0.06倍)比较有显著性差异(P<0.05)；与APS2.5mg(1.02±0.02倍)、NaB250μM(1.28±0.02倍)比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 ξ-mRNA表达上调1.18±0.03倍，与NaB500μM(1.16±0.03倍)及APS2.5mg(1.11±0.02倍)比较无显著性差异(P>0.05)；与NaB250μM(1.08±0.06倍)比较有显著性差异(P<0.05)。
　　 δ-mRNA变化无显著性差异，与各组比较均无显著性差异(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1首次为APS与NaB联合用药筛选到既有效诱导K562细胞红系分化又减轻细胞毒性的最佳浓度组合方案：APS2.5mg+NaB100μM、APS2.5mg+NaB250μM。
　　 2首次实验证实APS+NaB能使K562细胞β簇基因Gγ、Aγ、β、ε-mRNA表达上调，尤其是Gγ、Aγ、β-mRNA；而δ-mRNA表达无显著性变化；对α簇珠蛋白基因ξ、α-mRNA表达作用轻微。
　　 3首次实验证明APS+NaB低剂量联合用药比NaB常规剂量单用药能更有效诱导K562细胞向红系分化，增强γ珠蛋白基因表达上调，减轻细胞生长抑制及细胞毒性。
　　 4实验结果为诱导γ珠蛋白基因表达的联合用药研究增加了新的科学依据及研究思路，为临床联合用药新方案设计及实施提供理论基础。