黄芪多糖和丁酸钠联合用药对人红系细胞增殖和珠蛋白基因表达的作用

摘要

背景与目的：
　　 β-珠蛋白生成障碍性贫血(β-thalassemia，β-地贫)是常见的单基因遗传病，是世界上发病率最高的遗传性疾病之一。它的病理生理基础是β-珠蛋白基因的突变或缺失，造成相对过剩的α-珠蛋白链聚合形成包涵体，使红细胞生成减少、破坏过多而造成贫血。人类珠蛋白基因在个体发育的不同时间表现为阶段特异性的表达与关闭，α-珠蛋白基因簇表现为ξ→α基因的转换，而β-珠蛋白基因簇表现为ε→γ和γ→β基因的转换。自上世纪80年代开始的药物基因调控治疗，目前已进入了临床研究阶段，并取得了较好的疗效。γ-珠蛋白基因诱导剂的作用机制，是利用重新激活已近乎关闭的γ-珠蛋白基因表达，以改善α-和非α-珠蛋白链之间的不平衡，合成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)以弥补成人血红蛋白(adult hemoglobin，HbA)的不足，最终达到减少溶血、缓解贫血症状的目的。由于此类药物疗效显著，所以在这一研究方向上的探索具有特别重要的意义。
　　 目前研究的γ-珠蛋白基因诱导剂主要有：羟基脲(hydroxyurea，HU)、5-氮胞核苷(5-azaeytidine，5-AZAC)、丁酸盐类及其衍生物等。由于这些药物存在骨髓抑制、潜在的致癌性、半衰期较短和价格昂贵等缺点，所以在临床上的应用受到限制。因此，迫切需要发掘一些新的高效、低毒、价廉的γ-珠蛋白基因激活药物以改善治疗现状。与西药研制相比，中药研发周期短，可解决西药化合物人工合成难的问题，且疗效和毒副作用较明确，具有良好的研发前景。国内已有报道如益髓生血颗粒、黄根加味汤等中药方剂可重新激活γ-珠蛋白基因表达。但由于地贫基因表型多样，加上中药方剂成分较多，有效部分难以评估，所以目前许多学者致力于筛选出单味中药及其活性成分，如从一些抗肿瘤中药中筛选出了甲异靛、三尖杉酯碱等成分，旨在评估其治疗效果及作用机制。本课题组在前期实验中从益气补血、补肾升髓等中药中筛选出了单味中药黄芪，发现它可有效诱导K562细胞向红系分化，并上调γ-珠蛋白基因表达。
　　 因西药类γ-珠蛋白基因诱导剂的不良反应均存在不同程度的剂量依赖性，所以低剂量联合用药是一种值得研究的治疗途径，期望在减少药物剂量的同时，又能利用各药物作用靶点或机制的互补，使γ-珠蛋白基因表达增高。国外一些学者已在动物实验或临床研究中尝试将丁酸盐类与促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)或5-AZAC合用等，旨在探索不同的联合用药方式，发现某些药物联合应用可比单独用药更能显著提高γ-珠蛋白基因表达的水平。但也有观点认为，某些联合用药反而增加细胞毒性，且对HbF合成的调节作用的结论尚不一致，有待进一步研究。
　　 西药起效时间快，但作用时间不能持久且不良反应较大；中药起效虽慢，但药效维持时间较长且毒副作用较小。本课题组进一步研究证明：黄芪中起诱导γ-珠蛋白基因表达作用的有效成分主要是黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)，它不仅可诱导K562细胞向红系分化，而且可增加γ-珠蛋白基因表达和HbF合成。与西药丁酸钠(sodium butyrate，NaB)相比，它无明显细胞生长抑制作用，且诱导持续的时间较长。已知APS具有广泛的药理作用，是很有价值的免疫增强剂，对靶器官有明显的保护作用，可减轻放、化疗后的骨髓抑制等不良反应。且其他研究也发现，APS有刺激骨髓造血、增强免疫功能及抗肿瘤的作用，对骨髓细胞有保护作用。能否将中西药联合应用，达到优势互补、减少剂量的效果，值得进一步探讨。
　　 近年来国内外应用较广泛的红系细胞体外液体培养法是二步液体培养法，用此方法建立的红系细胞模型比K562细胞更能模拟人体内红细胞的生成过程，体现个体发育中珠蛋白基因表达的转换。
　　 本研究旨在探讨APS和NaB单独或联合用药对人红系细胞增殖和珠蛋白基因表达的影响。实验选用脐血来提取体外培养所需的造血干/祖细胞，并建立红系细胞二步液体培养法。以使用该液体方法培养的红系细胞为研究对象，观察正常红系细胞珠蛋白基因的表达规律，再进一步探讨单独或联合用药对珠蛋白基因表达的影响。并采用台盼蓝拒染活细胞计数、形态学观察和逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)等方法对培养的红系细胞进行观察和分析，探讨单独或联合用药对细胞增殖、细胞形态和各珠蛋白基因mRNA的表达等方面的影响，而此研究结果将会为临床联合用药新方案的设计和实施提供理论基础。
　　 方法：
　　 1脐血来源：
　　 标本来自于广州市南方医科大学南方医院产科健康产妇分娩胎儿脐带，排除传染性疾病、血液疾病、恶性肿瘤、各种严重妊娠并发症等病例，用无菌采血袋(PCD-A抗凝)密闭式方法保存。
　　 2实验分组：
　　 实验分为6组，APS+NaB(2.5 mg/mL+250μmol/L)为低剂量联药组，APS2.5 mg/mL、NaB250μmol/L为低剂量单药组，APS5.0mg/mL、NaB500μmol/L为常规剂量单药组，空白对照组为未加药组。
　　 3人红系细胞二步液体培养：
　　 从脐血中分离单个核细胞，分两步在两种不同的培养体系中进行人红系细胞的体外液体培养。在研究正常红系细胞在此液体培养过程中珠蛋白基因的表达规律时，分别在第二阶段的第0、2、4、6、8、10、12和14天采样；在研究单独或联合用药对红系细胞增殖和珠蛋白基因表达的作用时，在第二阶段的第6天按所需终浓度加药，然后分别在第8、10、12和14天采样。
　　 4台盼蓝拒染活细胞计数，观察人红系细胞在培养过程中不同时间点的增殖情况及药物对细胞抑制率的影响。
　　 5 RT-PCR技术分析人红系细胞7种珠蛋白基因(ξ，α，Gγ，Aγ，δ和β)在培养过程中不同时间点的表达情况。将各组与内参照表达量的值比较，得出相对光密度值；并以空白对照组表达量为1，计算其他组的表达倍数。
　　 6统计学方法：
　　 采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，不同时间点多组间的比较及固定浓度效应作时间因素的单独效应分析采用重复测量数据方差分析，固定时间效应作浓度因素的单独效应分析采用单向方差分析(One-Way ANOVA)，基于方差分析的多重比较如方差齐采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1体外液体培养人红系细胞的增殖及珠蛋白基因表达的变化1.1细胞计数变化红系细胞各时间点细胞增殖水平不同(F=655.682，P<0.001)。从第6天开始细胞数呈指数上升，第10天后增殖速度逐渐减慢进入平台期，至第12天达高峰(4.01±0.25)×106/ml(约为初始细胞数的4倍)。
　　 1.2各珠蛋白基因表达的变化α-珠蛋白基因簇：随着红系细胞的分化和成熟，α-mRNA的表达升高(F=19.845，P=0.046)，第14天达峰值0.96±0.12；ξ-mRNA只有少量表达，但不随红系细胞的成熟发生变化。
　　 β-珠蛋白基因簇：随着红系细胞的分化和成熟，β-mRNA的表达升高(F=28.936，P=0.028)，第14天达峰值0.96±0.20；Gγ-和Aγ-mRNA的表达下降(F=48.923，P=0.016；F=19.353，P=0.042)，第14天分别达最低值0.45±0.05和0.37±0.08；ε-和δ-mRNA有少量表达，但不随红系细胞的成熟发生变化；γ-和β-mRNA表达的交叉转换在第8～9天。
　　 2 APS和NaB单独或联合用药对人红系细胞增殖和珠蛋白基因表达的作用2.1 APS和NaB单独或联合用药对红系细胞增殖的影响用药后，各组的红系细胞从第8天开始增殖减弱，第10天后逐渐达到一个稳态，第12天APS+NaB联药组的细胞数(3.13±0.24)(×106/mL)大于NaB常规剂量组(2.88±0.19)(×106/mL)，小于APS常规剂量组(3.52±0.36)(×106/mL)。
　　 APS和NaB单独或联合用药对红系细胞均存在不同程度的抑制作用(F=18.616，P=0.000)。随着药物作用时间的延长，APS+NaB联药组抑制率的峰值(36.84±1.27)％小于NaB常规剂量组(44.55±2.83)％，大于APS常规剂量组(19.00±7.76)％(P<0.05)。
　　 2.2 APS和NaB单独或联合用药对红系细胞珠蛋白基因表达的影响APS+NaB低剂量联合用药后Gγ-mRNA水平上调的峰值为2.65±0.13倍(F=23.850，P=0.000)；大于APS和NaB常规剂量组(1.86±0.13和1.85±0.33倍)，差异有显著性(P<0.05)；亦明显大于APS和NaB低剂量组(1.23±0.09和1.38±0.22倍)，差异有显著性(P<0.05)。
　　 APS+NaB低剂量联合用药后Aγ-mRNA水平上调的峰值为1.53±0.23倍(F=53.714，P=0.015)；与APS和NaB常规剂量组(1.48±0.07和1.35±0.12倍)比，差异无显著性(P>0.05)；明显大于APS和NaB低剂量组(1.14±0.21和1.15±0.18倍)，差异有显著性(P<0.05)。
　　 APS和NaB单独或联合用药后的不同时间点，各组的β-、ε-、δ-、α-和ξ-珠蛋白基因表达水平与未用药组相比差异均无显著性(P>0.05)。
　　 结论：
　　 1成功建立了人红系细胞体外二步液体培养方法，证实了使用该方法体外培养的红系细胞能较好地模拟它在人体内的发育过程，为红系细胞分化、成熟过程中珠蛋白基因表达转换的研究提供了良好模型。
　　 2首次在体外液体培养的人红系细胞上证明，APS常规剂量单独用药可上调γ-珠蛋白基因的表达，尤其增加Gγ-mRNA的转录，且对细胞生长的抑制作用弱。对β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表达无明显影响，对α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表达也无显著作用。
　　 3首次在体外液体培养的人红系细胞上证明，APS和NaB低剂量联合用药可上调γ-珠蛋白基因的表达，尤其增加Gγ-mRNA的转录，且减轻了对细胞生长的抑制。对β-、ε-、和δ-珠蛋白基因等其他β-珠蛋白基因簇的表达无明显影响，对α-和ξ-珠蛋白基因等α-珠蛋白基因簇的表达也无显著作用。
　　 4首次在体外液体培养的人红系细胞上证明，APS和NaB低剂量联合用药比APS及NaB常规剂量单独用药，能更有效诱导γ-珠蛋白基因的表达，且减轻细胞生长抑制及细胞毒性。
　　 5本实验结果为诱导γ-珠蛋白基因表达的联合用药研究增加了新的科学依据及研究思路，为临床联合用药新方案的设计及实施提供了理论基础。