王氏连朴饮对脾胃湿热证大鼠Th1/Th2细胞因子、胃粘膜上皮细胞凋亡蛋白Bc1-2、P53的实验研究

摘要

目的:脾胃湿热证是感受湿热之邪，或过食肥甘厚腻，或脾气虚弱，湿邪中阻，久之酿成湿热，内蕴脾胃而表现的一类病证，为岭南地区的常见病、多发病。其临床症状复杂，病程较久，病势缠绵难愈，治疗较为困难。本实验根据脾胃湿热证的发病特点，通过“高脂高糖饮食+人工热气候模拟舱+生物致病因子”复合因素构建脾胃湿热证动物模型，用ELISA法检测血清Th1/Th2细胞因子IFN-γ/IL-4的表达水平;用SABC法检测胃粘膜上皮细胞凋亡基因相关蛋白Bcl-2、P53;并取大鼠胃、十二指肠和结肠组织行病理切片，HE染色观察胃肠道炎症情况。探讨脾胃湿热证与细胞免疫平衡、细胞凋亡之间的关系及王氏连朴饮的疗效，扩大脾胃湿热证的研究范围，加深对脾胃湿热证生物学基础及发病机制的认识，提高脾胃湿热证的现代研究及临床诊疗水平。
　　 方法:
　　 1.药物和饲料王氏连朴饮药物组成:制厚朴6克，川连、石菖蒲、制半夏各3克，香豉、焦山栀各9克，芦根60克。高脂高糖饲料:普通饲料中混入12％猪油，8％蜂蜜加工而成。
　　 2.实验动物分组将50只雄性SPF级SD大鼠适应性饲养3天后，随机分为5组:正常对照组、脾胃湿热模型组、王氏连朴饮（高、中、低剂量）组。每组10只。
　　 3.方法:本实验拟通过高脂高糖饮食+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％）+生物致病因子（109CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌）制成脾胃湿热证模型:①正常对照组:在20-28℃温度，65±5％相对湿度的自然环境下，以普通混合饲料喂养。②脾胃湿热证模型组:高脂高糖饲料+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％;每日上午9时至11时放入大鼠）。③王氏连朴饮高剂量组:高脂高糖饲料+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％;每日上午9时至11时放入大鼠）④王氏连朴饮中剂量组:高脂高糖饲料+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％;每日上午9时至11时放入大鼠）。⑤王氏连朴饮低剂量组:高脂高糖饲料+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％;每日上午9时至11时放入大鼠）。模型组与王氏连朴饮高、中、低剂量组第18天移出置于自然环境，按2ml/200g予鼠伤寒沙门氏菌灌胃1次，24小时后加强感染1次(1ml/200g)。第20日起王氏连朴饮高、中、低剂量组大鼠按2ml/200g灌服相应浓度的药物，正常对照组和脾胃湿热模型组灌服等容积生理盐水。每天给药一次，持续7天。
　　 4.观察及检测指标:实验期间每天记录大鼠饮水量和摄食量，分别于第10天、第18天和给药后测定大鼠体重，造模前、后及给药后测定肛温。实验结束后腹主动脉采血，离心后取血清，运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清IFN-γ和IL-4水平。取胃、十二指肠、大肠组织行光镜下病理组织学检查。按照免疫组织化学试剂盒说明书运用SABC法检测大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡蛋白Bcl-2、P53的表达。
　　 5.数据统计:原始数据采用SPSS13.0统计软件进行录入和分析，采用（(x)±s）等统计学指标进行数据的统计描述。体重、肛温、摄食量、饮水量采用重复测量(Repeatedmeasured)方差分析，IFN-γ和IL-4水平进行One-way ANOVA分析，方差齐性采用LSD进行两两比较，方差不齐性的采用Dunnett T3进行两两比较，等级资料采用秩和检验。设定P＜0.05表示统计学有显著性差异。
　　 结果:
　　 1.大鼠一般状态和摄食量、饮水量的变化实验前:所有动物状态良好，活动灵活，皮毛洁白有光泽，活动正常，摄食量饮水量正常，大便成形，小便、体温正常。
　　 实验后:正常对照组大鼠精神状态好，皮毛有光泽，反应灵敏，饮水量和摄食量均衡。第1天各组大鼠表现一致，无特异性差别。各造模组大鼠随着造模时间的推移，大部分出现倦怠、嗜卧懒动，反应迟钝，毛发蓬松，颜色枯槁，饮食饮水减少，排便次数增多。从造模第10天开始，均出现大便溏泄或粘腻，体温较前升高较快;进入人工热气候模拟舱后，大便溏泄或粘腻症状加重，渐见肛周污秽，摄食量和饮水量有减少的趋势，但统计学无显著性差异。王氏连朴饮（高、中、低剂量）组灌服王氏连朴饮后，活动逐渐增强，饮水、饮食量增加，大便渐渐恢复正常。
　　 2.体重和肛温正常对照组大鼠体重呈进行性增长，肛温无明显改变。与正常对照组比较，脾胃湿热模型组和王氏连朴饮高、中、低剂量组大鼠体重增长缓慢，但统计学无显著性差异，各组肛温均显著升高。给药后，王氏连朴饮高、中、低剂量组大鼠体重增长较模型组均有加快的趋势，但统计学无显著性差异;给药组大鼠肛温均显著降低。
　　 3.血清IFN-γ/IL-4比值与正常组相比，模型组与王氏连朴饮（高、中、低剂量）组血清IFN-γ、IL-4显著增高;模型组与王氏连朴饮（中、低剂量）组IFN-γ/IL-4呈增高趋势，但无显著性差异;王氏连朴饮高剂量组IFN-γ/IL-4显著增高。与模型组相比，王氏连朴饮（高、中、低剂量）组能显著降低血清IFN-γ、IL-4水平;王氏连朴饮（中、低剂量）组IFN-γ/IL-4呈增高趋势，但无显著性差异;王氏连朴饮高剂量组IFN-γ/IL-4显著增高。
　　 4.胃粘膜上皮细胞Bcl-2、P53蛋白表达与正常组相比，脾胃湿热证模型组Bcl-2，P53蛋白表达显著增强，王氏连朴饮（高、中、低剂量）组Bcl-2，P53蛋白表达轻度增加，但无显著性差异，其中以中剂量组最为接近正常组，效果最好。
　　 5.胃、十二指肠、大肠粘膜组织形态结构改变HE染色后，正常组大鼠胃粘膜层结构完整，十二指肠、大肠绒毛排列紧密，柱状上皮排列整齐。模型组大鼠胃粘膜组织不同程度充血水肿，固有层和粘膜下层可见大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞堆积;十二指肠和大肠可见粘膜组织充血水肿，上皮脱落、坏死，大量炎细胞浸润。王氏连朴饮高、中、低剂量组与模型组比较，大鼠胃粘膜结构清楚，十二指肠绒毛上皮较完整，固有层可见散在的炎细胞浸润。
　　 结论:
　　 1.在“高脂高糖饮食+人工热气候模拟舱+生物致病因子”复合因素作用下，大鼠的症状、体征等表现与脾胃湿热证的临床症候类似;经过王氏连朴饮治疗后，脾胃湿热证模型大鼠症候逐步恢复正常，也反证了脾胃湿热证大鼠模型造模成功。因此，“内湿热+外湿热+生物致病因子”可成功复制脾胃湿热证模型，模型大鼠可出现与脾胃湿热证的临床类似症候。
　　 2.脾胃湿热证模型组大鼠血清Th1、Th2细胞因子IFN-γ、IL-4表达水平明显升高，提示脾胃湿热证处于正邪抗争的病理状态，存在免疫平衡失调，细胞因子网络调节紊乱，有向Th1反应漂移的趋势。
　　 3.脾胃湿热证模型组Bcl-2，P53蛋白表达显著增强，表明细胞凋亡参与了脾胃湿热证发病的免疫调节及免疫耐受，细胞增殖与凋亡平衡紊乱促进脾胃湿热证的发生与发展。
　　 4.模型组大鼠胃粘膜组织充血水肿，固有层和粘膜下层可见大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞;十二指肠和大肠可见粘膜组织充血水肿，上皮脱落、坏死，大量炎细胞浸润，表明脾胃湿热证临床所表现的症状有一定的形态结构基础。
　　 5.王氏连朴饮药物组成:制厚朴6克，川连、石菖蒲、制半夏各3克，香豉、焦山栀各9克，芦根60克。功用:清热化湿，理气和中。临床主要用于湿温之湿热中阻证。本实验中王氏连朴饮对脾胃湿热证大鼠胃肠道粘膜细胞损伤有保护和修复作用。其清热祛湿的作用机制还可能与其调节Th1/Th2平衡、诱导脾胃湿热证大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡及抑制机体炎症反应相关。

目录

摘要

第一部分 研究背景

1．1 脾胃湿热证概述

1．2 脾胃湿热证动物模型研究概述

1．3 脾胃湿热证现代研究进展

1．4 结语

第二部分 实验研究

2．1 材料

2．2 方法

2．3 指标检测

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

附录：英文缩写对照表

硕士期间成果

致谢

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