三仁汤对脾胃湿热证大鼠Th1/Th2细胞因子、胃粘膜上皮细胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的影响

摘要

目的：
　　 脾胃湿热证是脾胃实证中的一个常见证型，是中医“证”的研究的重要内容。Th1/Th2细胞平衡、胃粘膜上皮细胞的凋亡与增殖在一定程度上体现了机体内阴阳的相互对立制约和相互作用，这与脾胃湿热证的阴阳合邪、正邪相争、阴阳的动态平衡存在着一定的联系。本实验根据脾胃湿热证的发病特点，通过“内湿热+外湿热+生物致病因子”复合因素构建脾胃湿热证动物模型，以该模型为基础，观察脾胃湿热证大鼠模型的体重、肛温等形态学改变，用ELISA法检测血清Th1/Th2细胞因子IFN-γ/IL-4的表达水平，取大鼠胃、十二指肠和大肠组织行病理切片，用SABC法行免疫组化染色检测胃粘膜上皮细胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的平均光密度，探讨脾胃湿热证与细胞免疫平衡之间的关系及三仁汤的疗效，有助于加深对脾胃湿热证生物学基础及发病机制的认识，提高脾胃湿热证的整体研究水平。
　　 方法：
　　 将50只雄性SPF级SD大鼠适应性饲养3d后，随机分为5组:正常对照组、脾胃湿热模型组、三仁汤（低、中、高剂量）组。以高脂高糖饮食+人工热气候模拟舱（环境设置为:干球温度33±0.5℃，相对湿度65±5％，每日上午9时至11时）+生物致病因子（109CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌）造成脾胃湿热证模型。模型复制完毕后三仁汤高、中、低剂量组大鼠按2ml/200g灌服相应浓度的药物，正常对照组和脾胃湿热模型组灌服等容积生理盐水。给药每天一次，持续7天。实验期间每天记录饮水量和摄食量，分别于造模前、造模第10天、第18天和给药后测定大鼠体重，于造模前、造模后及给药后测定肛温。实验结束后腹主动脉采血，离心后取血清，运用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清IFN-γ和IL-4水平。取胃、十二指肠、大肠组织行光镜下病理组织学检查。按照免疫组织化学试剂盒说明书运用SABC法检测大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡蛋白Fas、Bcl-2的表达变化。资料数据采用spss13.0软件进行重复测量(Repeatedmeasured)方差分析和One-wayANOVA分析，P＜0.05表示具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.大鼠一般状态和摄食量、饮水量的变化
　　 正常对照组大鼠精神状态好，皮毛有光泽，反应灵敏，饮水和摄食量均衡。和正常对照组比较，脾胃湿热模型组和三仁汤高、中、低剂量组大鼠在造模过程中逐渐出现精神萎靡，嗜卧懒动，皮毛无光泽，反应迟钝，大便稀或溏泄，肛周污秽，摄食量和饮水量有减少的趋势，但统计学无显著性差异(P＜0.05)。给药后与模型组大鼠比较，给药组大鼠一般状态逐渐好转，三仁汤高(P=0.001，P＜0.01)、中(P=0.024，P＜0.05)、低剂量组(P=0.022，P＜0.05)大鼠摄食量明显增加，饮水量有增加趋势(P＞0.05)。
　　 2.给药组对脾胃湿热证大鼠体重和肛温的影响
　　 正常对照组大鼠体重呈进行性增长，肛温无明显改变。与正常对照组比较，造模后，脾胃湿热模型组和三仁汤高、中、低剂量组大鼠体重增长缓慢，但统计学无显著性差异(P=0.152，P＞0.05)，各组肛温均显著升高(P＜0.001)。给药后，与模型组比较，三仁汤高、中、低剂量组大鼠体重增长较模型组均有加快的趋势，但统计学无显著性差异（P＞0.05）;给药组大鼠肛温均显著降低(P＜0.05)。
　　 3.给药组对脾胃湿热证大鼠血清IFN-γ表达水平的影响
　　 与正常对照组比较，脾胃湿热证模型组和三仁汤高、中、低剂量组IFN-γ表达水平明显升高（P＜0.001），以模型组为最高。与脾胃湿热模型组比较，三仁汤低、中剂量组能明显降低IFN-γ表达水平(P＜0.001)，三仁汤高剂量组有降低IFN-γ水平的趋势，但统计学无显著性差异(P＞0.05)。
　　 4.给药组对脾胃湿热证大鼠血清IL-4表达水平的影响
　　 与正常对照组比较，脾胃湿热证模型组和三仁汤高、中、低剂量组IL-4水平明显升高(P＜0.001)，以脾胃湿热模型组为最高。与脾胃湿热模型组比较，三仁汤高、中、低剂量组均能明显降低IL-4表达水平(P＜0.001)，以低剂量组效果最好。
　　 5.给药组对脾胃湿热证大鼠血清IFN-γ/IL-4比值的影响
　　 与正常对照组比较，三仁汤高剂量组IFN-γ/IL-4比值明显升高(P=0.001，P＜0.01)，模型组IFN-γ/IL-4比值有升高的趋势，但统计学无显著性差异(P＞0.05)。与脾胃湿热模型组比较，三仁汤高剂量组IFN-γ/IL-4比值明显升高(P=0.028，P＜0.05)，低剂量组有降低IFN-γ/IL-4比值的趋势，但统计学无显著性差异(P=0.144，P＞0.05)
　　 6.给药组对脾胃湿热证大鼠胃、十二指肠、大肠粘膜组织的影响（图1）
　　 HE染色后，光镜下观察，正常组大鼠胃粘膜层结构完整，十二指肠、大肠绒毛排列紧密，柱状上皮细胞排列整齐。模型组大鼠胃粘膜组织充血水肿，固有层和粘膜下层可见大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润;十二指肠和大肠可见粘膜组织充血水肿，上皮脱落、坏死，间质可见大量炎细胞浸润。三仁汤高、中、低剂量组与模型组比较，大鼠胃粘膜结构清楚，十二指肠绒毛上皮较完整，大肠上皮细胞排列整齐，固有层可见散在的炎细胞浸润。
　　 7.给药组对脾胃湿热证大鼠胃粘膜Fas蛋白表达的影响
　　 图像分析结果显示:正常对照组大鼠胃粘膜组织中Fas蛋白的表达主要在胃腺区，散在分布，细胞着色较深，呈中等阳性表达，胞浆呈棕黄染色(图2-A)。与正常对照组比较，脾胃湿热模型组中Fas蛋白表达减弱，细胞胞浆棕黄染色较浅，呈弱阳性表达（图2-B），Fas蛋白阳性细胞OD值显著下降(P=0.005，P＜0.01)。与模型组比较，三仁汤高、中、低剂量组Fas蛋白OD值均显著升高(P＜0.001)(图2-C～F)，呈中等阳性表达。
　　 8.给药组对脾胃湿热证大鼠胃粘膜Bcl-2蛋白表达的影响
　　 图像分析结果显示:正常对照组大鼠胃粘膜组织中Bcl-2蛋白的表达主要在胃腺区，散在分布，细胞着色较浅，呈弱阳性表达，胞浆呈淡棕黄染色（图3-A）。与正常组比较，脾胃湿热模型组中Bcl-2蛋白表达增强，细胞质着色深，呈强阳性（图3-B），OD值显著升高(P=0.016，P＜0.05)。与模型组比较，三仁汤低、中、高剂量组Bcl-2蛋白呈弱至中等阳性表达，OD值显著降低(P=0.043，P＜0.05)（图3-C～F），以低剂量组为最低。
　　 结论：
　　 1.“内湿热+外湿热+生物致病因子”可成功复制脾胃湿热证模型，模型大鼠可出现与脾胃湿热证的临床常见类似证候。
　　 2.脾胃湿热证模型组大鼠血清Th1、Th2细胞因子IFN-γ、IL-4表达水平明显升高，提示脾胃湿热证处于正邪抗争的剧烈的病理状态，存在免疫平衡失调，细胞因子网络调节紊乱，有向Th1反应漂移的趋势。
　　 3.脾胃湿热证模型组大鼠胃、十二指肠、大肠组织病理提示大量炎性细胞存在，表明脾胃湿热证临床所表现的症状有其形态结构基础。
　　 4.脾胃湿热证动物模型胃粘膜上皮组织Fas蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调，存在细胞增殖与凋亡的失衡。
　　 5.三仁汤能改善脾胃湿热证模型大鼠的湿热证候，其清热祛湿的作用机制可能与其抑制机体炎症反应、调节Th1/Th2平衡相关;对脾胃湿热证大鼠胃肠道粘膜细胞损伤有保护和修复作用，可能与诱导脾胃湿热证大鼠胃粘膜上皮细胞凋亡，上调Fas以及抑制Bcl-2的表达有关。

目录

摘要

第一部分 研究背景

1．1 脾胃湿热证动物模型的建立

1．2 脾胃湿热证现代研究进展

1．3 观察指标的选择

1．4 结语

第二部分 实验研究

2．1 材料

2．2 方法

2．3 指标检测

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

附录：英文缩写对照表

硕士期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明