动物组织中莱克多巴胺残留免疫检测方法研究

摘要

本文以butane-1,4-diol diglycidyl ether作为连接臂,采用直接偶联法,将半抗原莱克多巴胺与载体蛋白.牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫抗原RAC-BSA进行动物免疫,与辢根过氧化物酶(HRP)偶联得酶标抗原RAC-HRP,作为直接竞争酶联免疫的酶标记物；采用琥珀酸酐.混合酸酐法合成RAC-OVA,作为间接竞争的包被抗原进行抗血清效价测定。
　　 通过特定的免疫程序,免疫日本大耳白兔,获得了亲合性很高的抗莱克多巴胺的抗血清,经免疫亲和层析法纯化后获得多克隆抗体,建立直接竞争酶联免疫检测方法。结果表明,此方法具有较高的灵敏度,IC50为0.9ng/mL,检出限(IC15)为0.15 ng/mL；除了与多巴酚丁胺的交叉反应为7.5％外,与克伦特罗、沙丁胺醇、特步他林、异丙肾上腺素、和异奎胍均无交叉现象,说明抗体特异性较高。选择四种动物样品进行基质影响消除的研究,结果表明,采用PBS进行5倍提取后,便可消除基质影响,不需要有机溶剂和其他净化步骤,样品中的检出限达0.5 μg/kg；在样品中添加三个水平的莱克多巴胺浓度,回收率达60％以上,为莱克多巴胺快速检测试剂盒的研制奠定了物质基础。
　　 为开发快速检测试剂盒,论文进一步验证了抗体和酶标抗原稳定性及贮存条件。研究表明,抗体和酶标在4℃条件下储存半年以上而不影响检测性能,有利于莱克多巴胺试剂盒的推广和应用,从而实现对莱克多巴胺的有效监控。
　　 在建立了莱克多巴胺酶联免疫检测方法的基础上,还研究建立了莱克多巴胺化学发光酶免疫分析方法,对实现莱克多巴胺的高灵敏度、快速检测具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 研究背景

1.1.1 兽药和兽药残留现状

1.1.2 兽药残留的危害

1.1.3 兽药残留的控制措施

1.2 β-肾上腺素受体激动剂简介

1.2.1 β-肾上腺素受体激动剂结构与类型

1.2.2 β-激动剂的药理与毒理作用

1.3 莱克多巴胺简介

1.3.1 莱克多巴胺结构、性质

1.3.2 莱克多巴胺功能作用

1.3.3 莱克多巴胺毒性作用及限量标准

1.4 莱克多巴胺检测研究进展

1.4.1 常用的检测方法概述

1.4.2 色谱检测方法

1.4.3 免疫分析法

1.5 研究内容、目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验样品

2.1.2 主要药品:

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 常用溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 各种抗原的制备

2.2.2 抗体的制备与纯化

2.2.3 直接竞争酶联免疫(Direct competition ELISA,cdELISA)检测方法的建立

2.2.4 RAC-cdELISA各项指标的评价

2.3 莱克多巴胺快速检测试剂盒的研制

2.3.1 抗体稳定性实验

2.3.2 酶标抗原稳定性实验

2.4 增强化学发光酶联免疫分析(ECL-ELISA)方法的建立

2.4.1 测定步骤

2.4.2 基本工作浓度的优化

2.4.3 绘制标准曲线

2.4.4 样品基质研究

3 结果与讨论

3.1 莱克多巴胺抗体的制备与选择

3.1.1 莱克多巴胺抗体的制备

3.1.2 抗血清效价和亲和性的测定

3.1.3 抗体的纯化

3.2 直接竞争ELISA各条件的优化

3.2.1 cdELISA最佳工作浓度的确定

3.2.2 cdELISA反应体系条件优化

3.3 直接竞争ELISA检测方法的建立

3.3.1 直接竞争ELISA标准曲线的建立

3.3.2 灵敏度

3.3.3 精密度

3.3.4 特异性

3.3.5 准确度

3.4 试剂盒稳定性及保藏技术的研究与改进

3.4.1 抗体的稳定性

3.4.2 酶标抗原的稳定性

3.5 增强化学发光酶联免疫分析

3.5.1 包被抗体量的比较

3.5.2 不同酶标抗原稀释比例对ECL-ELISA灵敏度的影响

3.5.3 不同封闭液浓度对ECL-ELISA灵敏度的影响

3.5.4 RAC化学发光酶免疫分析的标准曲线

3.5.5 样品基质影响研究

3.5.6 小结

4 结论

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

8 致谢