表皮生长因子受体胞内酪氨酸激酶结构域的原核及真核表达研究

摘要

目的：1．研究人表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)胞内酪氨酸激酶结构域(tyrosinekinasedomain，TKD)的原核表达及纯化条件；2．研究在人肿瘤细胞中稳定表达人表皮生长因子受体胞内酪氨酸激酶结构域。 方法：1．构建原核表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的重组质粒pGEX／GST—EGFR-TKD，大肠杆菌表达目的融合蛋白GST—EGFR-TKD，经尿素变性、梯度尿素透析复性、纯化GST融合蛋白、肠激酶去除GST“标签”后获得人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白；2．采用磷酸钙共沉淀基因转染技术，将已构建的pEF—BOS／GST—EGFR-TKD质粒DNA与pBabe—puro质粒DNA共同导入体外培养的人非小细胞肺癌细胞系m299中，嘌呤霉素加压筛选转染细胞以获得成功转染的细胞，免疫荧光法检测重组质粒在H1299中的表达水平及定位。 结果：1．限制性内切酶分析和DNA测序表明已成功构建重组质粒pGEX／GST—EGFR—TKD，SDS-PAGE分析表明异丙基硫代一B—D半乳糖苷(IPTG)诱导下可表达融合蛋白GST-EGFR-TKD，但以不溶性包涵体的形式存在。经尿素变性，梯度透析复性及肠激酶去除GST“标签”后可获得重折叠的人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白；2．经嘌呤霉素筛选，8d后对照组细胞全部死亡。转染组一些细胞存活形成单克隆集落，经多次传代培养后，荧光显微镜下观察见多数集落的细胞胞质内有较强GST-EGFR—TKD表达。 结论：1．在大肠杆菌中可成功表达人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域蛋白；2．通过磷酸钙共沉淀法可成功转染H1299细胞，并获得稳定表达EGFR_TKD‘的人’肿瘤细胞。

目录

摘要

前言

第一部分人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域原核表达

第二部分人EGFR胞内酪氨酸激酶结构域在人肿瘤细胞中的稳定表达

结论

参考文献

表皮生长因子受体及其在肿瘤靶向治疗中的研究进展

Appendix Ⅰ

致谢