细菌L-乳酸发酵及其代谢通量分析的研究

摘要

本文主要对L-乳酸生产菌株(Lactobacillus casei YBQl-1)进行了诱变选育,并研究了突变株YBQH2-14发酵条件对生产L-乳酸的影响,构建了L.casei YBQH2-14的代谢网络模型,分析了分批发酵不同阶段的代谢通量,同时研究了L-乳酸的应用——黑麦麸皮粉发酵.对L.casei YBQl-1进行紫外线照射诱变处理,以CaCO<,3>-溴甲酚紫平板、高锰酸钾-溴化钾平板、高糖平板、乳酸梯度平板、纯乳酸平板进行筛选,最后得到一株耐高糖、高酸的正向突变株YBQH2-14,其在发酵培养基中L-乳酸产量达到93g/L,对糖转化率达到77.5﹪,比出发菌株产酸提高48.5﹪.对菌株L.casei YBQH2-14的发酵培养基进行了优化,研究了碳源(大米糖化液、玉米淀粉糖化液和葡萄糖)对L-乳酸产量的影响,其中大米糖化液培养基L-乳酸产量达到105g/L;有机氮源(蛋白胨、玉米浆和酵母膏)和无机氮源(NH<,4>Cl、(NH<,4>)<,2>HPO<,4>)对L-乳酸产量的影响,并运用响应面分析法(中心组合设计)设计了葡萄糖、蛋白胨、NH<,4>Cl和(NH<,4>)<,2>HPO<,4>四因素的响应面分析实验.结果表明,适宜的培养基C/N比(质量比)为12:1~13:1,确定的培养基组成为:葡萄糖120.13g/L、蛋白胨19.342g/L、NH<,4>Cl 4g/L、(NH<,4>)<,2>HPO<,4> 2.0096g/L,乙酸钠0.5g/L,MgSO<,4>·7H<,2>O 0.2g/L,MnSO<,4>·4H<,2>O 0.01g/L,FeSO<,4>·7H<,2>O 0.01g/L,NaCl 0.01g/L,ZnSO<,4>·7H<,2>O 0.2 g/L,优化后的培养基适合于对L.casei YBQH2-14进行代谢网络分析.同时,对L.casei YBQH2-14的培养条件进行了优化,确定了最佳发酵温度为37℃;并对H<'+>和游离乳酸对菌体生长和产酸的影响进行了研究,实验结果表明:乳酸对菌体生长和产酸的影响程度随pH的下降而加强.论文在分析了胞内EMP途径、TCA循环和氧化磷酸化等途径之后,基于化学计量平衡方程,构建了L.casei YBQH2-14代谢网络模型.应用代谢通量分析法,得到了不同发酵阶段L.casei YBQH2-14的胞内代谢通量分布.最后,论文对黑麦麸皮生粉乳酸发酵进行了研究.添加α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和纤维素酶能提高L.casei YBQH2-14对黑麦麸皮粉的利用率,从而提高产酸水平,并设计了三因素三水平的正交实验.各种酶的最适添加量为α-淀粉酶15 u/g干淀粉,中性蛋白酶和酸性蛋白酶各l u/g原料,纤维素酶15u/g原料,糖化酶80 u/g干淀粉,L-乳酸产量达到25g/L.

目录

文摘

英文文摘

1、前言

1.1乳酸的理化性质

1.2 L-乳酸及其衍生物的应用

1.3国内外L-乳酸及乳酸产品的生产状况

1.4 L-乳酸的生产方法

1.4.1化学合成法

1.4.2酶法合成

1.4.3发酵法生产

1.5发酵法生产L-乳酸的现状及发展趋势

1.5.1霉菌发酵生产L-乳酸

1.5.2细菌发酵生产L-乳酸

1.5.3细菌和根霉生产L-乳酸的比较

1.6 L-乳酸生产菌株的选育

1.6.1 L-乳酸的生物合成及相关代谢途径

1.6.2 L-乳酸生产菌株应具备的主要特征及其选育

1.7诱变剂及其诱变选育的方法

1.7.1物理诱变剂

1.7.2化学诱变剂

1.8乳酸发酵新工艺

1.9代谢工程简介

1.9.1代谢通量分析简介

1.9.2代谢通量分析理论及方法

1.9.3乳酸的初级代谢途径工程

1.10发酵生产L-乳酸的应用——黑麦麸皮粉发酵

1.11论文的主要研究内容

2、材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2主要实验试剂及仪器设备

2.1.3主要培养基

2.2实验方法

2.2.1分析方法

2.2.2出发菌株的筛选及发酵实验

2.2.3紫外线诱变育种

2.2.4突变株与出发菌株的性能比较

2.2.5基本发酵工艺

2.2.6培养基优化

2.2.7发酵条件的优化

2.3发酵过程代谢通量分析

2.3.1以葡萄糖浓度对L-乳酸发酵的影响

2.3.2发酵过程中pH对L-乳酸发酵的影响

2.3.3数学计算

2.4黑麦麸皮发酵实验

2.4.1黑麦麸皮不同发酵工艺的比较

2.4.2不同酶制剂对黑麦麸皮粉发酵的影响

3、结果与讨论

3.1出发菌株的筛选及发酵实验

3.1.1出发菌株的筛选

3.1.2出发菌株降糖曲线和产酸曲线的绘制

3.1.3出发菌株生长曲线的绘制

3.2 L-乳酸高产菌株的选育

3.2.1致死率曲线的制作

3.2.2紫外线诱变后分离菌种的发酵性能

3.2.3耐高浓度葡萄糖突变株的选育

3.2.4耐高浓度乳酸突变株的选育

3.2.5突变株生长曲线的绘制

3.2.6 L-乳酸的测定及外标工作曲线的制作

3.2.7突变株与出发菌株的发酵性能比较

3.2.8突变株菌种稳定性

3.3发酵培养基优化

3.3.1不同碳源及其质量浓度对L-乳酸发酵的影响

3.3.2有机氮源及其质量浓度对L-乳酸发酵的影响

3.3.3蛋白胨质量浓度对L-乳酸发酵的影响

3.3.4无机氮源及其质量浓度对乳酸发酵的影响

3.3.5利用响应面分析法优化培养基

3.4发酵条件的优化

3.4.1最佳发酵温度的选择

3.4.2 H+和游离乳酸对菌体生长和产酸的影响

3.5不同pH及葡萄糖浓度对YBQH2-14生产L-乳酸的影响

3.5.1不同pH下YBQH2-14生产L-乳酸的动力学特征

3.5.2 YBQH2-14发酵生产L-乳酸耐酸机理的探讨

3.5.3葡萄糖浓度对L-乳酸发酵的影响

3.6 YBQH2-14代谢网络模型的建立及其代谢通量分析

3.6.1 YBQH2-14代谢网络的建立

3.6.2分批发酵不同阶段的代谢通量分析

3.6.3运用代谢通量分析方法造成误差的可能原因

3.7黑麦麸皮发酵实验

3.7.1黑麦麸皮不同发酵工艺的比较

3.7.2不同酶制剂对黑麦麸皮粉发酵的影响

附录

4、结论

5、展望

6、参考文献

7、致谢

8、研究生期间发表论文情况