岩溪晚芦成熟果皮与果肉差减cDNA文库的构建及初步分析

摘要

我国柑橘产业发展迅猛，已成为世界第二大柑橘生产国。然而长期以来，我国柑橘品种早、中、晚熟熟期搭配不合理、晚熟品种偏少的问题一直未能得到有效的解决，国产柑橘每年有半年的空档期，国外则乘虚而入，逐渐占领柑橘类水果的高端市场。因此，如何实现国产柑橘鲜果周年均衡供应颇为重要。 岩溪晚芦(Citrus reticulata)是我国从普通槿柑选出的晚熟变异品种，相同条件下，其成熟期比普通椪柑迟40-60天，果实品质优良，耐寒性较强。岩溪晚芦果实成熟过程中，果皮和果肉必然有着各自不同的内在作用机理，受其自身一系列基因的表达与调控作用。有效发掘与其外观和内质相关的优异基因具有十分重要的意义。 本研究以桠柑成熟果皮为材料，利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)，富集椪柑果皮和果肉的差异表达基因，构建了岩溪晚芦果皮与果肉的差减cDNA文库，通过对文库筛选、克隆测序和功能分析，发掘与其外观和内质相关的优异基因，以便为今后进一步的基因功能分析、全长基因克隆及基因改造等研究打下基础。 分别以成熟桠柑果肉作为抑制性差减文库的实验材料(Driver)、以成熟果皮作为抑制性差减文库的材料(Tester)，采用自行改进的LiCl沉淀法，分别提取以上两种材料的总RNA，按照Oligotex mRNA Mini Kit试剂盒操作分离纯化mKNA，获得了高质量的mRNA。采用SSH试剂盒操作方法进行抑制性差减杂交，先将两种材料mRNA行反转录成双链cDNA，经Rsa Ⅰ酶切，再将Tester酶切产物分成两份：一份与Adoptorl连接，另一份与Adoptor2R连接；将抑制性差减杂交第二次PCR的产物纯化后连接至pTZ57R/T载体中，转化到DH5 a感受态细胞，经蓝向斑筛选、培养，用T/A克隆法，DH5 α为受体菌，菌斑经统计共9784个，其中蓝斑87个，差减文库重组率达99.1％。构建了库容量为1019个克隆的差减cDNA文库。随机对文库中100个白色克隆抽提质粒后检测，有96个阳性克隆均能检测到明显的条带，插入片段长度集中在100～500bp，与预期插入片段相一致。随机挑选了770个克隆进行测序，成功测出411个EST，其中有377个与已知基因具有较高的相似性，它们分属126个基因，其中1个基因出现频率最高达31次，为假想的一种蛋白；1个基囚出现频率达28次，为未命名的蛋白产物；1个基冈出现频率达25次，为假想的叶绿体RF1；5个基因出现频率在10～20之间；55个基因出现频率在2～1之间，其中大部分集中在2～5之间；63个基因只出现1次。文库中，低拷贝基因和高拷贝基因同时存在。这些基因涉及到了色素合成、能量代谢、初级代谢、次生代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化(衰老)、精油代谢、抗氧化代谢、涩味消失以及结构、运动、基因表达等等生理生化过程，大多均为果皮组织特异表达基因。另外还有涉及到涩味变化、三价铁螯合物、反转录转座子gag蛋白、查尔酮、硼离子转运、儿茶酚氧位甲基转移酶等功能的基因。功能已知且不重复的EST共有63个，占总数的49.2％。此外有5个基因共62个克隆虽在Blast搜索时找到了较高的序列同源性，但目前尚未明确功能。有待于进一步深入分析。Blast检索结果显示，另有34个基因功能未知。通过分析说明，本实验初步达到了差减特异表达基因的目的。

目录

文摘

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声明

第1章文献综述

1.1果实成熟机理

1.2果实成熟时发生的重要变化

1.3基因调控果实成熟研究进展

1.4差减cDNA文库

第2章引言

2.1研究的目的与意义

2.2主要技术路线

第3章材料和方法

3.1实验材料

3.2实验方法

第4章结果与分析

4.1总RNA提取与mRNA分离纯化

4.2 SSH文库构建

4.3文库中重组子鉴定

4.4测序与序列分析

第5章讨论

5.1柑橘果皮与果肉总RNA的提取与mRNA的质量

5.2抑制性差减杂交技术分离差异表达基因的有效性

5.3文库阳性克隆筛选与鉴定

5.4差异表达基因Blast比对分析

第6章结论

6.1总RNA提取与mRNA分离纯化

6.2 cDNA文库构建

6.3文库阳性克隆鉴定

6.4所选克隆的测序和和分析

参考文献

附录

致谢

在学期间所发表的文章、获奖的论文及参加的项目