脐带间充质干细胞静脉输注治疗晚期视网膜色素变性的临床转化研究

摘要

目的:视网膜色素变性(Retinal pigmentosa，PR)是一类严重的致盲性眼病。主要病理改变是感光细胞及视网膜色素上皮（Retinal pigmented epithelium，RPE）的退行性变;临床表现为自幼发生的夜盲，进行性视野缺失。眼底视乳头颜色蜡黄，视网膜血管变窄、僵直以及典型的“骨细胞样”色素沉着。视网膜色素变性疾病的发生发展严重影响着人们的视觉功能和生活质量，但目前临床上仍无明确有效的治疗方法。
　　在治疗晚期RP的众多方法中，干细胞移植被视为目前最具前景的治疗方法之一。有报道称，国外已开展多项利用间充质干细胞移植治疗湿性老年性黄斑变性、Stargardt病、视网膜色素变性等视网膜变性疾病的临床试验，而干细胞治疗其他疾病的临床研究，包括各类自身免疫性疾病、血管性疾病、器官移植等，也已被证实是安全可行的。脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)作为干细胞移植的一个重要来源，相比骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞而言，可通过非侵入性方式获得，并且在向多胚层细胞分化、促进损伤修复、抑制炎症反应及神经营养等方面，更具有优势。而干细胞移植的途径主要有局部移植及全身移植。然而RP晚期病人由于视网膜色素上皮细胞破坏殆尽，不具备做局部干细胞移植的条件，因而经静脉输注干细胞治疗晚期RP，探索其治疗的安全性和有效性，使得UC-MSC静脉输注移植成为延缓晚期RP病人失明的最具前景的方案之一。
　　有动物实验表明，皇家外科学院大鼠(Royal College Surgeon rat,RCS)大鼠尾静脉输注间充质干细胞后，能够向视网膜节细胞层、内核层及外核层归巢，并对外层视网膜发挥保护作用。而目前国内外也有多项有关MSC用于临床治疗的研究，并在研究中观察到MSC移植具备良好的安全性和耐受性，并未发现受者出现免疫排斥、感染等严重不良反应。
　　综上所述，本课题的目的在于先通过动物实验，研究UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的有效性，作为临床转化的动物桥接实验，在此基础上，进一步探讨在临床中应用UC-MSC静脉输治疗晚期视网膜色素变性患者的安全性及有效性。
　　方法:第一部分:UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的有效性研究
　　1、RCS大鼠静脉输注UC-MSC后1周、2周时，对RCS大鼠视网膜铺片、冰冻切片进行免疫组化染色，观察是否有移植的UC-MSC定向归巢到视网膜。在不同时间点分别测量视网膜冰冻切片外核层厚度并进行闪光视网膜电图的检查，从形态学及功能学方面来探讨UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的有效性。
　　2、RCS大鼠静脉输注UC-MSC后1周、2周时，运用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法，检测RCS大鼠血清中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)的浓度变化，从神经营养及免疫调节方面来探讨UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的可能机制。
　　第二部分:UC-MSC静脉输注治疗晚期RP患者的安全性及有效性研究
　　1、病例纳入:严格按照纳入、排除标准，筛选出符合要求的视网膜色素变性患者，所有纳入病例均由本人签署项目及手术知情同意书。本临床研究已获得第三军医大学第一附属医院伦理委员会临床试验批准，批件号:2014年科研第44号。
　　2、所有纳入研究的患者均进行UC-MSC静脉输注治疗。分别于术前、术后1月、2月、3月、6月进行随访观察。
　　3、对所有入组患者进行安全性评估:(1) UC-MSC静脉输注后生命体征观察，(2)是否出现感染发热、局部疼痛、过敏反应、输注反应及免疫排斥反应等;进行血、尿常规及肝肾功能检测，胸片检查等;(3)局部眼部是否出现红肿、疼痛及视力下降等。
　　4、对所有入组患者进行有效性评估:(1)形态学方面:进行眼底照相及眼底荧光素造影(fundus fluorescein angiography，FFA)、光学相干断层扫描(optical coherencetomograpy，OCT)检查;(2)功能学方面:进行最佳矫正视力（best corrected visualacuity，BCVA）、视觉诱发电位(visual evoked potential，VEP)、视野检查，并进行统计分析;(3)完成视觉量表(National Eye Institute Visual Functioning Questionnaire，NEI_VQF-25)的填写;(4)相关炎症因子的检测。
　　结果:第一部分:UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的有效性研究
　　1、RCS大鼠尾静脉输注UC-MSC后的1周、2周通过视网膜免疫荧光检测进行形态学观察。大量视网膜铺片和切片均表明:视网膜各层无确切的移植细胞，提示: UC-MSC静脉输注后能难以向视网膜定向归巢。然而在移植后各点，实验组的视网膜外核层厚度均较对照组更厚(P＜0.05)。功能学方面，闪光视网膜电图检查结果表明，实验组在移植后暗适应b波幅值较对照组更高，1周时差异具有统计学意义(P＜0.05)。该部分研究结果显示，UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠后，病变组织外层视网膜得到有效保护，视功能较对照组提高，提示UC-MSC静脉输治疗RCS大鼠的有效性不是通过干细胞替代治疗实现的。
　　2、RCS大鼠尾静脉输注UC-MSC后，实验组血清中BDNF的浓度均高于对照组，在2周时差异具有统计学意义(P＜0.05)。实验组血清中IL-10的浓度较对照组升高，在1周时差异有统计学意义;IL-6的浓度较对照组略降低，差异无统计学意义。实验结果提示，全身移植UC-MSC可能通过神经营养及抗炎作用延缓了RCS大鼠的视网膜感光细胞变性。
　　第二部分:UC-MSC静脉输注治疗晚期RP患者的安全性及有效性研究
　　1、共纳入晚期视网膜色素变性患者16例32眼，均符合纳入、排除标准。
　　2、16例患者均完成UC-MSC静脉输注治疗，其中1例患者在治疗后2月、6月时失访，1例患者在治疗后6月时失访，其余所有患者均完成5次随访。
　　3、安全性研究:(1)16例患者UC-MSC治疗前后生命体征平稳(2)无一例患者否出现感染发热、疼痛、过敏反应、输注反应及免疫排斥等反应;血、尿常规、肝肾功检测及胸片检查均无异常;(3)眼部未出现红肿、疼痛及视力下降等。
　　4、有效性研究:UC-MSC治疗后，(1)形态学方面:眼底彩照及FFA荧光表现无明显变化，OCT结果提示治疗前后黄斑中心凹及黄斑区平均厚度较稳定(P＞0.05)，其中1例治疗前诊断黄斑水肿的病人在治疗后第3个月水肿明显减轻，但在6个月时再次出现水肿;(2)功能学方面:最佳矫正视力在治疗后有逐渐上升的趋势，在治疗后第2、3、6个月时BCVA与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且在第3个月时有显著提高;PVEP的P100波幅值、A/L比值在1个月时有升高趋势但无统计学意义。FVEP的P2波幅值、A/L比值在治疗前后没有统计学意义的改变。视野结果提示治疗后视野范围及视野敏感度总和较治疗前呈增加趋势但无统计学意义。(3)NEI_VQF-25量表评分在治疗后3月、6月时均提高，3月时分数差异有统计学意义(P＜0.05);(4)炎症因子检测:血降钙素原(procalcitonin，PCT)基本正常，仅1例患者治疗前略高于正常值，治疗后降至正常;
　　结论:1、UC-MSC静脉输注RCS大鼠后，尚无明确证据证明UC-MSC归巢到视网膜，但可能通过神经营养及抗炎的旁分泌机制对外层视网膜发挥保护作用，延缓了RCS大鼠的视网膜感光细胞变性。
　　2、UC-MSC静脉输注治疗晚期RP患者是安全、有效的。通过UC-MSC静脉移植能延缓晚期RP患者病情的进展，有效的高峰期在治疗3月后。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠的有效性研究

2．1 UC-MSC静脉输注治疗RCS大鼠视的形态学和功能学研究

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．2 UC-MSC静脉输注后对RCS大鼠作用的机制研究

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 UC-MSC静脉输注治疗晚期视网膜色素变性患者的安全性及有效性研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．3 小结

全文结论

参考文献

文献综述 干细胞治疗视网膜变性疾病的研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢