anti-CD20scFv/IgGFc/ζ载体的构建及转染人类外周血T淋巴细胞

摘要

目的：构建抗CD20阳性淋巴瘤的重组真核表达载体PLNCX／anti-CD20。scFv-Fc．，并使之转染包装细胞PA317，为进一步转染外周血T淋巴细胞以及杀伤CD20阳性的淋巴瘤提供有效的生物治疗细胞，从而获得一种特异针对CD20阳性恶性淋巴瘤靶向治疗的基因重组T细胞。 方法：1、构建逆转录病毒表达载体(pLNCX／anti-CD20scFv／IgGFc／ζ)：以质粒pBULLET为模板，PCR反应扩增目的片段ζ链，用TA克隆法将目的基因连接至克隆载体pCR-TOPO，经ClaI酶切鉴定克隆载体pCR-TOPO／ζ的正确性，经ClaI酶切后产物在紫外线下割胶，经胶纯化后。同时ClaI酶切含anti-CD20scFv／IgGFc片断的表达载体PLNCX，使用碱性磷酸酶去磷酸作用四小时后，两者以合适的比例混和后，用连接酶T4连接两个目的片断基因，再转染感受态的大肠杆菌E．coliDH5a，过夜培养后涂布于含氨苄青霉的LB培养皿上，次日挑取阳性的克隆置于含氨苄青霉素的液体LB培养基，菌落PCR初步鉴定重组表达载体pLNCX／anti-CD20scFv／IgGFc／ζ，ClaI单酶切鉴定pLNCX／anti-CD20scFv／IgGFc／‘，由于系单酶切后的连接反应，故产物没有特异性，有正连，反连，甚至串连等许多可能，必须经多次测序才能测定所需的连接产物，故最后测序才能筛选出所需的pLNCX／anti-CD20scFv／IgGFc／ζ重组基因片断。 2、转染包装细胞PA317细胞株：先在培养瓶里培养PA317细胞，待细胞生长状况良好后，以细胞浓度1×106／ml接种到六孔板里，待细胞铺满大约80％的面积时，先用无抗生素含小牛血清的培养基DMEM培养24小时后，使用脂质体¨opfectin2000转染PA317细胞株，转染l8—48小时后，换上含有抗生素和小牛血清的DMEM培养，同时加入筛选药物G418，每3～4天换液一次，经G418浓度800ug／ml筛选两周后，筛选出阳性的细胞克隆，经PCR反应粗略的检测载体转染结果，并用流式检测‘链的表达情况。如表达阳性，可用NIH3T3细胞系测定病毒滴度，病毒滴度高的包装细胞PA317可以用于下一步外周血T细胞的转染。 3、外周血T细胞的分离和转染：从健康人抽取外周血10mi，使用Ficoll分离液做密度梯度离心法，分离的外周血T细胞接种在培养瓶里，培养条件为10％胎牛血清的RPMll640，37~C的CO,培养箱中。加入5万U/ml的IL-2药液为12μl，使其最终浓度一直维持在50U/ml，同时加入lmg／ml的PHA-L为2uL使其终浓度为lug／ml，并加入OKT330ng/ml，共刺激三天，流式细胞术检测．CD3阳性的细胞，待阳性达到90％以上时，进行下一步的细胞转染，转染后用流式术检测载体在T细胞上的表达情况。 结果： l、重组逆转录病毒表达载体pLNCX／anti-CD20scFv／IgGFc／ζ成功构建，经菌落PCR，内切酶鉴定初步筛选出成功的重组载体， 2、目的基因片断可以表达在PA317包装细胞上，在经G418筛选获得大量稳定转染的PA317细胞，经PCR和流式细胞术检测转染的结果。包装细胞PA317可以产生逆转录病毒。产生的逆转染病毒可以进一步转染外周血T细胞，并在其、表面稳定表达，为以后筛选合适的特异针对CD20阳性淋巴瘤靶向治疗的基因重组T细胞打下坚实的基础。 结论： l、通过分子克隆成功的构建anti-CD20scFv／IgGFc／‘逆转录病毒载体，为转染真核细胞创造了条件。 2、真核表达载体anti-CD20scFv／IgGFc／‘能够表达在PA317细胞包装细胞，并且可以产生较高的病毒滴度，成功地转染外周血T细胞，构建了针对CD20阳性淋巴瘤靶向治疗的基因重组T细胞，为CD20阳性淋巴瘤的特异性生物治疗创造条件。

目录

前言

材料与方法

结果

分析与讨论

参考文献

图片

附录

小结

致谢

综述 抗CD20单抗在血液疾病中的治疗进展