Toll样受体9基因多态性与儿童哮喘的相关性研究

摘要

目的：TLRs是一类先天性免疫模式识别受体，它具有连接先天性免疫和适应免疫的桥梁作用。TLR9的激活可诱导适应性免疫的Th1转化作用，其在哮喘发病中可能有重要作用。外国有研究结果发现其基因多态性可能与哮喘或湿疹有关，但也有研究得出相反的结论，提示TLR9多态性存在种族差异。本研究对中国儿童TLR9的单核苷酸多态性进行研究，探讨其与哮喘之间的相关性：（1）检测中国汉族儿童TLR9的单核苷酸多态性的分布情况，并分析其与哮喘易感性之间的关系；（2）分析TLR9单核苷酸多态性与哮喘严重程度之间的关系；（3）分析TLR9单核苷酸多态性与血浆细胞因子水平的相关性；（4）分析TLR9单核苷酸多态性与血清TIgE、D1IgE和特应质之间的相关性。 方法：2007年4月至2008年11月收集的303例哮喘患儿（哮喘组）和139名健康对照儿童（对照组）的TLR9基因-1486和-1237位点的单核苷酸多态性采用DNA直接测序法进行测定分析。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定哮喘组血浆中IFN-γ、IL-12和IL-4的水平；采用化学发光法测定哮喘组血清总IgE水平，采用酶免疫荧光法检测血清D1IgE。 结果：（1）哮喘组和对照组在扩增的548bp长度的序列中，发现-1486位点存在多态性，基因型有TT、TC和CC三种类型，以TC型为主。-1237位点野生基因型为TT，该位点突变仅在哮喘组（1/303）和对照组（1/139）中各发现1例，基因型为TC。哮喘组TT、TC和CC三种基因型的频率分别是40．3%、48．2%和11．6%，等位基因T的频率为64．4%，C为35．6%；对照组三种基因型的频率分别是41．7%、43．9%和14．4%，等位基因T和C的频率分别为63．7%和36．3%。两组基因型及等位基因构成比差异无统计学意义（x2分别为1．0427和0．0391，P均>0．05）。 （2）哮喘组-1486位点三种基因型的哮喘严重程度构成比差异有统计学意义（x2=14．187，P=0．007），但是TC和TT基因型比较差异无统计学意义（x2=1．066，P=0．587），即TC和TT基因型儿童“中、重度持续”比例较低，CC基因型哮喘患儿“中、重度持续”比例较高。 （3）哮喘组血浆IFN-γ在三种基因型患儿间的差别有统计学意义（x2=12．288，P=0．002），哮喘组CC基因型的血浆IFN-γ水平低于TC和TT基因型患儿；IL-12在三种基因型患儿间的差别无统计学意义（x2=1．801，P=0．406）；IL-4在三种基因型患儿间的差别有统计学意义（x2=15．656，P=0．000），TC基因型的血浆IL-4最低，CC基因型的次之。 （4）哮喘组-1486位点三种基因型的特应质情况（x2=2．130，P=0．345）、1gTIgE（F=0．385，P=0．681）和D1IgE（x2=1．960，P=0．375）水平差别无统计学意义。 结论：（1）中国汉族儿童存在TLR9基因-1486位点的单核苷酸多态性，该位点的单核苷酸多态性与哮喘易感性无关。中国汉族儿童不存在-1237位点的单核苷酸多态性。检测以上两个位点基因型对于判断某儿童对哮喘是否易感无参考价值。 （2）TLR9基因-1486位点的单核苷酸多态性与患儿哮喘严重程度相关，含有CC基因型的儿童患“中、重度持续哮喘”的比例较高，而含有TC和TT基因型的儿童较低。哮喘患儿测定-1486位点的基因型对判断哮喘的预后具有重要的意义。 （3）TLR9基因-1486位点的单核苷酸多态性与哮喘组血浆中IFN-γ和IL-4的水平相关，与IL-12水平无相关性。 （4）TLR9基因-1486位点的单核苷酸多态性与哮喘组血清TIgE、D1IgE及特应质无相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

材料和方法

1研究对象

2标本采集

3主要仪器及试剂

4实验方法

4.1模板DNA提取

4.2引物设计

4.3 PCR扩增

4.4 PCR扩增产物检测(琼脂糖凝胶电泳法)

4.5 PCR产物纯化

4.6 PCR产物测序

4.7细胞因子检测

5统计学处理

结果

1一般资料

2 TLR9基因多态性在哮喘组和对照组中的分布

3哮喘组-1486位点不同基因型的哮喘严重程度构成比

4 哮喘组-1486位点不同基因型的血浆细胞因子水平

5哮喘组-1486位点不同基因型的TIgE、D1IgE水平及与特应质的关系

分析与讨论

1 TLR9的结构与功能

2 TLR9单核苷酸多态性与哮喘易感性之间的关系

3哮喘组-1486位点多态性与疾病严重程度之间的关系

4 哮喘组-1486位点多态性与血浆细胞因子的关系

5哮喘组-1486位点多态性与特应质、血清总IgE和D1IgE之间的关系

结论

今后研究方向

参考文献

个人信息

致谢

综述：Toll样受体9及其配体研究进展