RNA干扰沉默Ki67基因影响肾癌细胞增殖和凋亡研究

摘要

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术沉默Ki67基因的表达，研究其对人肾癌786-0细胞增殖和凋亡影响，为RNAi用于肾癌基因治疗提供实验基础。 方法: 1．Ki67 shRNA转录模板DNA链的设计、合成按siRNA设计原则，设计针对Ki67基因cDNA 364～384位置碱基序列的siRNA。再根据siRNA序列设计总长度为63bp的shRNA转录模板DNA正、反义链二条。 2．shRNA表达质粒pSilencerKi67的构建 将等量的将正、反义二条转录shRNA对应模板的DNA序列，煺火处理后克隆至pSliencer。将重组体转化大肠杆菌JMlO1感受态细胞，提取重组质粒用限制性内切酶BamH I、HindIII将其切成二条片段，电泳观察插入子及载体片段的分子量。重组质粒命名为pSilencerKi67。 3．体外实验用LipofectamineTM2000将pSi lencerKi67转染人肾癌786-0细胞，以空质粒pSliencer及未转染的细胞作对照。在转染后24h、48h、72h,120h及144h收集样本，采用RT-PCR检测Ki67mRNA表达、Western blOt和免疫组化检测Ki67蛋白表达、MTT方法检测细胞的增殖、TNUEL法检测细胞的凋亡。 4．体内实验 取786-O细胞接种于雌性、4～6周龄BALB／C／nu裸鼠背部皮下组织内。当肿瘤生长至直径10mm时随机分为3组，即对照组(A)、空质粒组(B)、DSilencerKi67组(C)。将pSilencerKi67(20μg／K)每隔2天瘤内注射，共7次。然后处死全部动物，取肿瘤组织行免疫组化染色检测Ki67的表达，TUNEL法检测细胞凋亡。 （1）.限制性酶切及测序证实质粒pSi lencerKi67构建成功。 （2）．转染pSilencer Ki67后24h、48h、72h、120h及144h，786-0细胞Ki67mRNA表达水平(41.7±1.5、34.1±1.7、54.5±3.7、71.1±2.5、81.6±2.6)％均显著低于空质粒pSliencer、未转染的细胞(97.7±0.9，100)％；经蛋白印迹检测786-0细胞Ki67蛋白水平为(47.3±1.6、42.6±1.6、59.6±2.7、75.6±1.6、78.7±2.1)％均显著低于两对照组(97.3±1.6，100)％；786-0细胞的相对抑制率分别为(62.3±4.5、76.74±3.2、73.3±6.4、53.2±5.2、49.2±2.7)％均显著低于两对照组(70.1±5、0)％；786-0细胞的凋亡率分别为(18.7±4.5、38.3±3.0、74.3±5、23.5±3.7、19.1±2.5)％均显著低于两对照组(8.4±1.1，7.2±1.3)％。实验证实pSilencerKi67比对照组显著抑制786-0细胞Ki67mRNA、Ki67蛋白表达，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡(P<0.01)。 （3）.免疫组化检测Ki67的表达，A组阳性率平均为(33±2)％％；B组平均为(30±3)％；C组平均为(124±4)％。C组肿瘤中Ki67的阳性率比与A，B组相比明显降低(P<0.01)。细胞凋亡率A组平均为(13±5)％；B组平均为(14±4)％；C组平均为(76±2)％。C组肿瘤中细胞凋亡率比与A、B组相比明显升高(P<0.01)。 结论:应用RNA干扰技术沉默Ki67基因可以降低人肾癌786-0细胞Ki67的表达，抑制细胞的增殖，同时引起细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。

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综述 RNA干扰在泌尿系肿瘤基因治疗中的应用

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