卡氏肺孢子虫55kDa抗原基因克隆与表达

摘要

目的：体外扩增卡氏肺孢子虫55kDa抗原(p55)基因及690bp的基因片段，构建原核表达载体pGEX/690，诱导表达重组蛋白。 方法：取肺孢子虫肺炎大鼠肺组织制备卡氏肺孢子虫(Pc)DNA，并以此模板扩增p55基因，将PCR产物与pGEM-T载体连接，转化E.coliDH5a，在含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基上筛选出重组子，提取质粒、酶切鉴定及测序验证插入的DNA片段，并进行序列比较分析；接着，用生物信息学知识分析p55蛋白理化性质和抗原表位等；最后，用RT-PCR扩增p55基因690bp片段，克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌，筛选出重组子、提取质粒双酶切、PCR、测序鉴定；并以IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达产物。 结果：PCR扩增获得长度为1286bp的序列，测序结果与报道的基因序列相比，有三处核苷酸不同，同源性为99..8％，推导的氨基酸序列完全相同。RT-PCR扩增的片段为708bp，将其克隆入pGEX-4T-1中，构建重组质粒，双酶切获得了一个大小与其相应PCR扩增产物一致的插入片段，测序验证读码框架完全正确。用IPTG诱导表达，重组质粒在大肠杆菌中表达出p55与谷胱甘肽转移酶(GST)的融合蛋白，表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在，与生物信息学预测的蛋白可溶性结果相一致。重组蛋白分子量约为56kDa，表达量占菌体总蛋白的11.09％。 结论：本研究从卡氏肺孢子虫DNA中成功获得p55基因、成功构建了p55cDNA重组原核表达质粒pGEX/690，并表达出融合蛋白。表达产物与生物信息学预测的可溶性结果一致。p55基因的克隆与表达，为进一步开展p55蛋白的结构、生物活性以及p55致病机制、基因工程疫苗等研究奠定基础。

目录

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英文缩略词表

前言

第一部分p55基因克隆和分析

第二部分p55生物信息学分析

第三部分p55抗原部分片段的克隆与表达

结论

参考文献

综述肺孢子虫病免疫学研究进展

致谢