大豆异黄酮早期暴露对子宫平滑肌瘤的影响及机制研究

摘要

本研究旨在(1)利用整体实验探讨参与Gen发育暴露引起CD-1小鼠发生子宫肌瘤的可能分子机制；(2)利用体外实验阐明Gen对人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的剂量效应关系；(3)鉴别人子宫平滑肌瘤细胞在高低不同剂量Gen作用下中有显著性表达差异的基因，并对可能参与的信号通路进行研究；(4)探讨低剂量Gen引起人子宫平滑肌瘤细胞而非正常子宫平滑肌细胞增生的机制，为阐明环境雌激素对子宫肌瘤的发生、发展的影响提供实验依据。本研究结果可提高我们对环境雌激素暴露对子宫平滑肌瘤生长影响的认识，可为外源性和内源性雌激素造成子宫平滑肌瘤生长提供新的解释，可为进一步研究子宫平滑肌瘤生长的表遗传机制提供理论依据。 第—部分 雌性(CD-1)小鼠大豆异黄酮新生暴露引起雌激素受体一alpha和胰岛素样生长因子-I受体在子宫肌瘤中表达升高 为进一步探讨可能参与Gen发育暴露引起子宫肌瘤的发生的分子机制，本文将新出生CD-1小鼠(1.6±0.04 g)随机分成对照组和染毒组。染毒剂量为：对照组O mg/(kg·d)、低剂量组O.5mg/(kg·d)、中剂量组5mg/(kg·d)和高剂量组50mg/(kg·d)，从出生后第一天开始染毒，每天皮下注射，连续染毒5天。分别于12个月和18月后处死小鼠，按实验需要分离子宫等脏器。随后对子宫进行处理，包埋，切片。根据对组织切片的形态学观察以及免疫组化染色，发现： 1．在中剂量组5mg/(kg·d)和高剂量组50mg/(kg·d)暴露组，雌性小鼠(CD-1)在12个月和18月时出现肿瘤。但是对照组O mg/(kg·d)和低剂量组O.5lrig/(kg·d)组的子宫平滑肌未发现有子宫肿瘤的发生。 2．免疫组化染色结果表明ERα、磷酸化ERα、IGF-I、IGF-IR以及磷酸化MAPK P44/42在子宫平滑肌瘤的表达量明显高于正常子宫平滑肌组织中的蛋白表达量。 结论：以上结果表明，雌性小鼠(CD-1)Gen新生暴露可在生长后期引起子宫平滑肌瘤的发生，并且肌瘤的发生与染毒剂量有关。ERα、磷酸化ERα、IGF-I、IGF-IR以及磷酸化MAPK P44/42在子宫平滑肌瘤的表达升高提示Gen新生暴露可能干扰了ERα和IGF-IR信号转导通路，并且ERα和IGF-IR信号转导通路可能直接参与子宫平滑肌瘤的生长。本研究同时提示Gen虽为弱雌激素物质，早期婴儿喂养豆奶配方应引起关注。 第二部分 大豆异黄酮对体外培养人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的生长影响 妇女是否因食物摄入大豆异黄酮(Gen)而造成对子宫平滑肌或已有子宫平滑肌瘤的影响?利用培养的人子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞，本文评价了Gen在0.001-50μg/ml浓度内，对这两种细胞的生长影响。用光镜观察了细胞的形态学改变；用MTS方法测定了细胞增生效应；用免疫细胞化学对增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)进行了染色；用流式细胞仪观察了细胞周期；用荧光测定和激光共聚焦方法，对caspase-3活性及凋亡小体进行了测定。主要结果如下： 1．低剂量(O.00l-1μg/ml)Gen对子宫平滑肌瘤细胞有显著的增生促进作用，细胞保持了固有的长条形特征。细胞核PCNA染色增加。S一期细胞数增多。但是在Gen低剂量作用下，正常子宫平滑肌细胞没有出现以上改变。 2．高剂量(10—50μg/ml)Gen作用下，子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞的生长均受到明显抑制，细胞形态被破坏，细胞核PCNA染色减少。与低剂量和对照处理组相比，在高剂量Gen处理下两种细胞G2/M期细胞比例升高，G1期细胞比例降低，caspase-3活性升高，出现细胞凋亡。 结论： Gen对子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞呈现剂量依赖关系。低剂量Gen仅能引起人子宫平滑肌瘤细胞的增生效应。而在高剂量条件下，Gen能够改变子宫平滑肌瘤细胞和正常子宫平滑肌细胞两种的细胞形态，抑制细胞增生，升高caspase-3活性，引起细胞凋亡。而且，后两种作用在正常子宫平滑肌细胞上更明显。 第三部分 毒理基因组学分析体外培养子宫平滑肌瘤细胞在大豆异黄酮作用下基因表达谱以及高剂量作用的机制研究 为探讨Gen对人子宫平滑肌瘤细胞的影响及作用机制，用Agilent Whole Human Genome arrays分析了子宫平滑肌瘤细胞在两个特定浓度低(1 μg/mL)和高(50μg/mL)的Gen作用下，基因表达谱的改变特征。并且用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析软件，我们对筛选出的特征基因作了进一步分析。依据Ingenuity Pathways KnowledgeBase提供的数据，这些特征基因被构建为特定基因网络、功能和信号通路。本文对高浓度Gen引起子宫平滑肌瘤细胞抑制作用的机制作了深入研究。用实时反转录聚合酶链反应(real-tilme RT-PCR)和蛋白免疫印记分析方法(Western blotting)，验证了特定通路中感兴趣的基因。在此基础上，本文还在16个子宫平滑肌瘤病人组织样本中对这些基因的蛋白表达进行了验证。主要结果如下： 1．低浓度(1μg/ml)Gen对子宫平滑肌瘤细胞增生作用的基因表达谱的改变主要为：(1)有27个基因表达发生了显著改变(以1．5倍为标准，P

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摘要

Section Ⅰ:Neonatal genistein exposure increases estrogen receptor(ER)alpha and insulin-like growth factor-I(IGF-I)receptor expression in the development of uterine leiomyoma

Introduction

1.Materials and methods

2.Results

3.Discussion

References

Section Ⅱ:In vitro study:the effects of genistein on human uterine leiomyoma cells and normal uterine smooth muscle cells

Introduction

1.Materials and Methods

2.Results

3.Discussion

References

Section Ⅲ:Insights from toxicogenomics:High-dose of genistein down-regulates TGF-beta pathway genes in human uterine leiomyoma cells

Introduction

1.Materials and methods

2.Results

3.Discussion

References

Section Ⅳ:Low-dose genistein promotes the interactions between estrogen receptor alpha and insulin-like growth factor-I receptor leading to uterine leiomyoma cell proliferation

Introduction

1.Materials and methods

2.Results

3.Discussion

References

附录

Acknowledgements

致谢