组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA诱导的转录调节及反义HDAC1对MCF-7细胞影响的实验研究

摘要

细胞内乙酰化和去乙酰化是组蛋白翻译后修饰的主要方式，是调节基因表达的一个重要因素，越来越多的实验表明组蛋白乙酰化的失衡与肿瘤发生存在着密切的联系，平衡的打破成为某些肿瘤形成或发展的直接因素。本实验中我们从药物制滴菌素(trichostatinA，TSA)及基因水平阻断组蛋白去乙酰化酶，抑制组蛋白去乙酰化酶活性或下调其基因表达，观察处理因素所致的细胞效应，探讨乙酰化与去乙酰化修饰在MCF-7细胞中的影响。 实验中我们发现TSA作用后，MCF-7细胞活性下降，随时间的延长及剂量的增加，细胞效应更加明显，呈现时间和剂量依赖性；ADnexin-V/PI凋亡分析显示在不同梯度浓度的TSA作用48h后，McF-7细胞出现凋亡，随着剂量的增加凋亡率逐步升高；周期实验分析显示0.50μmol/L的TSA作用48h、72h后，与空白对照相比，MCF-7细胞呈现明显的G2期阻滞，但无凋亡出现；进一步的的琼脂糖电泳实验显示0.50μmol/L TSA作用无明显的180-200bp的梯度出现；其后的转录调节分析显示除．P21基因上调外，ERa、myc-c、eyelin-D及Bcl-2均下调，同朝着增殖抑制、周期阻滞及凋亡的方向发展，表明TSA有效地引起了基因转录的变化，其所致的细胞效应可能与转录调节有关。 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)在药物水平能被阻断，RNA水平是否也可实施阻断呢?我们选基因编号为NM 004964的HDACl进行阻断。经RNA提取、反转录及PCR后，成功扩增目的片段，反向插入该片段入pcDNA3.1(-)真核表达载体，经酶切鉴定及测序分析，表明成功构建pcDNA3.1-HDACl反义质粒；大量扩增、纯化目的质粒DNA，进行瞬时转染。瞬时转染72h后的HDACl基因分析显示空白及空质粒组目的基因无明显变化，反义组条带强度明显比空白及空质粒组弱，凝胶灰度分析显示反义组相对于空质粒组下降了57％；此外，还发现阳性对照TSA组也下调了HDACl，强度比反义组更明显。转染后的细胞活性实验也显示反义基因具有细胞增殖抑制作用，反义HDACl降低了MCF-7细胞的活性，空质粒组与空白组与之相比无明显变化；进一步的细胞流式实验表明反义基因能使细胞周期阻滞，使细胞S期减少，阻滞于G1、G2期。上述实验表明HDAC可在药物及基因水平被阻断，MCF-7细胞的肿瘤形成中可能存在乙酰化与去乙酰化修饰的紊乱，HDACl是有效的去乙酰化酶，在乙酰化修饰中可能起重要作用；阻断HDAC酶的活性可引起肿瘤细胞增殖抑制、周期阻滞或凋亡，HDAC酶可能用来作为肿瘤治疗的新靶点。

目录

声明

前言

第一部分TSA诱导MCF-7细胞转录调节过程中的细胞毒性作用

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分反义HDAC1对乳腺癌MCF-7细胞的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

小结

致谢

综述

附录