CMVE-pCEA嵌合启动子驱动的双自杀基因HSV-TK/CD对不同CEA表达水平的肺癌细胞系的体外杀伤作用研究

摘要

肺癌在中国甚至全世界都是发病率及病死率增长最为迅速的恶性肿瘤，每年全世界有超过100万人死于肺癌。常规的治疗方法对于肺癌患者5年生存率的提高和生存质量的改善作用都已达到平台期，目前急需一种更有效，更直接，更安全的治疗方法。基因疗法提供了一种全新的治疗模式，一系列的实验研究结果亦表明，基因治疗与常规治疗的联合应用能提高对肺癌患者的治疗效果[1]。其中转基因治疗就是通过把外源性的基因导入肿瘤细胞或肿瘤周围组织，从而引起细胞的死亡或者增殖抑制达到治疗的目的[2]。自杀基因（suicide gene）作为转基因治疗的其中一种重要模式，以其低毒，高效的特点，成为该领域的研究热点。目前研究最为成熟的自杀基因系统是HSV-TK/GCV和CD/5-FC。由于单自杀基因治疗易产生耐药，并且不同肿瘤细胞对自杀基因系统的敏感性不同，所以双自杀基因的联合应用可以产生协同作用，减少耐药，增加疗效。为了能使自杀基因在肿瘤细胞中靶向性表达，我们可以利用肿瘤组织特异性调控元件调控自杀基因在肿瘤细胞中表达，引起特异性杀伤作用。本课题组成功构建的CMVE-pCEA-TK-IRES-CD重组载体，是以pCEA作为启动子，靶向针对CEA阳性表达的肺癌细胞。该载体进入CEA阳性的肺癌细胞后，可特异性的启动下游的HSV-TK/CD自杀基因表达，特异性杀伤CEA阳性的肺癌细胞。本课题选择不同CEA表达水平的肺癌细胞系，检测CMVE-pCEA-TK-IRES-CD载体的靶向性表达，同时，观察丙氧鸟苷（Ganciclovir，GCV）、5-氟尿嘧啶（5-flucytosine，5-FC）两种前体药物对肺癌细胞的杀伤效应，比较在不同CEA表达水平的肺癌细胞系中，药物杀伤作用的差异以及双自杀基因的协同化作用。 目的：通过双自杀基因HSV-TK/CD转染不同CEA表达水平的肺癌细胞系并进行体外杀伤作用的观察，确定该系统的靶向性启动及双自杀基因表达后化疗前体药物GCV和5-FC对肺癌细胞的杀伤效应和协同作用，为进一步的临床实验提供依据。 方法：使用免疫组化，普通RT-PCR及荧光定量RT-PCR的方法鉴定A549，SPC-A-1，NCI-H520，16HBE细胞有无CEA的表达及表达量的差异。然后以EGFP为观察对象，使用脂质体2000，通过条件优化，获得各细胞的最优转染效率，并以此最优效率进行目的基因的转染。把已成功构建并经测序鉴定的重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP转染到不同CEA表达水平的肺癌细胞A549，SPC-A-1，NCI-H520，16HBE中，观察绿色荧光蛋白的表达，确定CEA启动子的靶向性。然后把含有双自杀基因的载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD转染到CEA阳性的A549，SPC-A-1细胞中，经G418筛选获得稳定的抗性克隆，并用荧光定量PCR检测转染载体后的A549/TK+CD，SPC-A-1/TK+CD细胞mRNA中TK，CD基因的表达量。WST-1法检测前体药物单一或联合应用对转染细胞A549/TK+CD，SPC-A-1/TK+CD的杀伤作用。另外，按不同比例分别混合A549/TK+CD和A549细胞，SPC-A-1/TK+CD和SPC-A-1细胞，药物干预下观察旁观者效应。用流式细胞仪检测不同药物浓度下单一或联合用药时细胞的凋亡和周期改变情况，用电镜观察药物干预下的细胞超微结构改变。 结果：免疫组化，RT-PCR及荧光定量PCR检测发现A549及SPC-A-1细胞为CEA阳性细胞，而NCI-H520，16HBE细胞为CEA阴性细胞，且A549细胞的CEA表达量要明显高于SPC-A-1细胞，转染CMVE-pCEA-IRES-EGFP后，EGFP的表达量与肺癌细胞内CEA表达水平相关。各肺癌细胞系的转染效率均能达到70%或以上，阴性对照的16HBE则为54%。嵌合启动子CMVE-pCEA调控下能启动下游报告基因在CEA阳性的肺癌细胞A549，SPC-A-1中表达。经G418抗性克隆筛选后，RT-PCR证实TK/CD基因导入目的细胞中。5-FC和GCV对A549/TK+CD，SPC-A-1/TK+CD细胞有明显的细胞毒作用，半数抑制浓度（IC50）分别为624.7996μg/ml，1713.6470μg/ml和169.8896μg/ml，638.7062μg/ml。而对于未转染TK/CD基因的A549，SPC-A-1细胞的IC50则为为972.1121μg/ml，2726.485μg/ml和718.9112μg/ml，1569.045μg/ml。转基因前后对比分别为1.56，1.59和4.23，2.46倍。联合用药有明显的协同作用，两药相互作用指数（CDI）<1。流式细胞仪检测发现细胞凋亡及细胞周期变化与药物浓度相关，与单一或联合用药有关。电镜检查可观察到药物干预下的细胞超微结构呈凋亡改变。 结论：通过多种方法确定了各细胞的CEA表达水平，且发现在CEA阳性的A549，SPC-A-1细胞中，荧光表达水平与CEA表达水平相关。双自杀基因表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD只能成功导入CEA阳性的A549，SPC-A-1细胞中。化疗前体药物对转染的A549/TK+CD，SPC-A-1/TK+CD细胞有更强的直接细胞毒作用，能诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖，而联合用药具有协同作用。为下一步研究双自杀基因对CEA阳性的肺癌患者的肿瘤杀伤作用奠定了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文词汇对照表

声明

前 言

第一部分各细胞CEA的测定，转染效率的优化以及A549／TK+CD，SPC-A-1／TK+CD细胞的制备

材料与方法

结 果

第二部分双自杀基因系统对不同CEA表达水平的肺癌细胞系的体外杀伤作用实验

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

小 结

综述 肺癌基因治疗的研究进展

致 谢