CD4CD25调节性T细胞在特发性血小板减少性紫癜发病机制中的作用

摘要

【目的】 1.研究ITP患儿外周血中CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞数量和比例的变化，探讨该细胞数量的变化在ITP发病机制中的作用。 2.研究ITP患儿外周血中CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞相关细胞因子IL-10 和TGF-β<,1>的水平，探讨它们在ITP患儿发病中的作用及与CD4<'+>CD25<'+>调节性T 细胞的关系。 3.研究ITP患儿外周血T淋巴细胞中CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞特异性标志Foxp3-mRNA及其蛋白的表达变化，探讨它们在ITP患儿发病中的作用及与CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的关系。 【方法】 1.外周血T淋巴细胞的分离 取ITP患儿及正常对照外周静脉血，肝素抗凝。淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，置玻璃培养皿中37℃孵育30min去除单核细胞，加入0.85％NH<,4>Cl溶液溶解红细胞，经 T 细胞分离富聚柱(h CD3<'+> T Cell Enrichment Column)获得纯化的T细胞。加入0.2ml 20％小牛血清Hanks液重悬T细胞，调整T细胞浓度至2×10<'6>/ml。FITC 标记的抗CD3单克隆抗体检测其纯度，台盼蓝拒染法检测其活性。 2.CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞数量与比例的检测 采用流式细胞术检测 T 淋巴细胞中 CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的数量与比例，取分离的T细胞悬液分别加入抗CD4-FITC，抗CD25-PE的单抗，同型对照分别为 IgG<,1>-FITC，IgG<,1>-PE，检测T淋巴细胞中CD4<'+>、CD25<'+>、CD4<'+>CD25<'+>的表达并进行分析。 3.CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞相关细胞因子含量的检测 用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中IL-10、TGF-β的水平，按试剂盒说明书操作，用酶联免疫检测仪以450nm比色，测吸光度(OD)值，以标准品含量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样本浓度，以pg/ml表示。 4.CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞特异性标志Foxp3-mRNA的水平和蛋白表达的检测 T淋巴细胞悬液抽提总RNA，RT-PCR一步法特异性扩增Foxp3-mRNA，琼脂糖凝胶电泳RT-PCR的扩增产物，采用凝胶成像系统分析Foxp3-mRNA的水平；T淋巴细胞悬液涂片，免疫组化法检测T淋巴细胞FOXP3蛋白的表达。 【结果】 1.分离纯化所得T淋巴细胞的纯度和活性均大于95％。 2.与正常对照组相比，ITP 患儿外周血CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的数量及比例均明显降低。 3.与正常对照组相比，ITP 患儿外周血中 IL-10、TGF-β<,1>的含量明显降低；ITP组中CD4<'+>CD25<'+>调节性 T 细胞的数量与IL-10、TGF-β<,1>的含量存在着正相关关系。 4.与正常对照组相比，ITP患儿外周血CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞特异性表面标志Foxp3-mRNA及其蛋白的表达均明显降低；CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞与Foxp3-mRNA 水平之间存在着高度正相关关系；Foxp3-mRNA的表达与IL-10、TGF-β<,1>也有正相关关系存在。 【结论】 1.本研究所采用的T细胞分离纯化方法可用于科学研究。 2.ITP患儿外周血中CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的数量和比例明显减少，可能发挥有效的免疫抑制作用减弱，使自身反应性T细胞激活增多，表明CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞可能参与了ITP的免疫病理机制。 3.ITP患儿外周血中CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞相关细胞因子含量降低，与CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞存在着正相关关系，说明Tr细胞可能是通过分泌抑制性细胞因子来发挥免疫抑制作用。细胞因子含量的降低说明CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞抑制功能受损。 4.ITP患儿外周血T淋巴细胞中Foxp3-mRNA的水平及蛋白表达明显降低，而且 CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞与Foxp3-mRNA 的水平呈高度正相关，说明Foxp3可以作为鉴定CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的标志，CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞主要是通过细胞接触抑制来发挥免疫抑制作用；Foxp3表达的降低可能导致CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的异常。此外，Foxp3-mRNA的表达与IL-10、TGF-β<,1>也有正相关关系存在，IL-10、TGF-β<,1>可能参与Foxp3表达的调节。

目录

声明

1前言

1.1研究背景

1.2研究目的

1.3研究内容

2外周血T淋巴细胞的分离、纯化与鉴定

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

3 ITP患儿外周血CD4+CD25+调节性T细胞数量的研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3 讨论

4 ITP患儿外周血CD4+CD25+调节性T细胞相关细胞因子的检测

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

5ITP患儿外周血CD4+CD25+调节性T细胞中Foxp3-mRNA及蛋白的表达

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

6 小结

参考文献

文献综述 CD4+CD25+调节性T细胞在自身免疫病中的研究进展

致谢

附录